[发明专利]一种将外源基因导入闭颖授粉籼稻品种的遗传转化方法

权利要求书

1.一种将外源基因导入闭颖授粉籼稻品种的遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

步骤1、提取水稻种子的胚，将所述胚置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

步骤2、将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养；

步骤3、对所获得的愈伤组织与携带所述外源基因的农杆菌接触，进行农杆菌侵染；

步骤4、对所述愈伤组织进行前筛选；

步骤5、将经前筛选的愈伤组织转移至筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

步骤6、对所述抗性愈伤组织进行分化再生，以分化成苗；

步骤7、将所获得的苗转移到生根培养基中生根。

2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，所述水稻种子为闭颖授粉籼稻品种9m90的种子。

3.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，

所述步骤1包括将所述水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，所述愈伤组织诱导培养基中[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM，并且含有30μM氯化钴。

4.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，

所述步骤3包括：将所述步骤2中获得的愈伤组织与携带外源基因的农杆菌接触15分钟，然后将所获得的愈伤组织转移到垫有无菌滤纸的培养皿中在21-23℃培养48小时；

所述步骤4包括将愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

所述步骤6包括将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗。

5.根据权利要求4所述的遗传转化方法，其特征在于，所述无菌滤纸中加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基，所述农杆菌悬浮培养基中[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM；

所述愈伤组织转移筛选培养基中[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM，并且含有30μM氯化钴；

所述分化再生培养基中[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝20mM/20mM，并且含有30μM氯化钴、1mg/L激动素(KT)和1mg/L萘乙酸(NAA)；并且

所述生根培养基中含0.4mg/L的NAA。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，

所述步骤1中的种子是成熟种子；和/或

所述诱导培养基包括N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麦芽糖、2mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、30μM氯化钴、8g/L琼脂；和/或

所述步骤3中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；和/或

所述农杆菌悬浮培养基包括预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2,4-D、20g/L麦芽糖、10g/L葡萄糖、100μmol/L乙酰丁香酮；和/或

所述前筛选培养基包括预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麦芽糖、2mg/L2,4-D、30μM氯化钴、8g/L琼脂、250mg/L羧苄青霉素；和/或

所述筛选培养基包括预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L麦芽糖、2mg/L2,4-D、30μM氯化钴、8g/L琼脂、50mg/L潮霉素、250mg/L羧苄青霉素；和/或

所述生根培养基包括1/2MS基础盐2.l65g/L、MS维生素、20g/L蔗糖、25mg/L潮霉素、0.4mg/L萘乙酸、125mg/L羧苄青霉素、3.5g/L植物凝胶。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3包括农杆菌菌株的培养和悬浮液准备，所述农杆菌菌株的培养包括进行两次活化。