[发明专利]一种在真核细胞内其稳定性受蓝光调控的光敏降解子desVVD

说明书

本发明提供了一种在真核细胞内其稳定性受蓝光调控的光敏降解子desVVD、该光敏降解子desVVD的编码基因、包含该编码基因的重组质粒载体。本发明提供了用该重组质粒载体制备光敏降解子desVVD或其突变体的方法，还提供了包含靶标蛋白融合该光敏降解子desVVD的融合蛋白。本发明的光敏降解子desVVD及融合该降解子的融合蛋白在真核细胞内的稳定性受蓝光调控。本发明提供通过蓝光控制或改变靶标蛋白在宿主细胞中的蛋白质水平的方法。该方法具有改变幅度大、蓝光灵敏度高、作用时间短、可恢复性强、细胞毒性小等优点。

技术领域

本发明涉及基因技术领域、生物化学领域、细胞生物学和生物物理学领域，涉及一种在真核细胞内其降解速率和稳定性受蓝光调控的光敏蛋白质降解子。具体说，利用蓝光提高光敏降解子在真核细胞内的稳定性，而在避光条件下该光敏降解子在真核细胞内发生降解。融合该光敏降解子的融合蛋白质在真核细胞内的降解和稳定性同样受到蓝光调控。

背景技术

基因敲除和RNA干扰技术是研究细胞内蛋白质功能最常用的方法。但是基因敲除技术无法获得看家基因编码的蛋白质缺失的表型。RNA干扰技术在研究蛋白质功能中最大的缺陷是对于稳定性高的蛋白质来说，编码的mRNA降解后，该蛋白质仍然在细胞内存在很长时间。RNA干扰是一个催化过程，没有浓度依赖的关系。同时，RNA干扰存在明显的非特异性，可能对其它细胞过程产生影响[Raina等：J Biol Chem,2010,285(15):11057-11060]。因此，目前对于研究看家基因编码的蛋白质的功能还没有特别有效和直接的方法。

条件性控制蛋白质降解的蛋白质敲除技术是研究蛋白质功能最直接的方法。目前已经报道的条件性控制蛋白质降解的方法主要有两种方式：温度控制[Dohmen等,Science,1994,263(5151):1273-1276]、化学小分子控制[Schneekloth等,J Am Chem Soc.2004,126(12):3748-3754；Nishimura等,Nature Methods.2009,6(12):917-U978；Pratt等,P NatlAcad Sci USA.2007,104(27):11209-11214；Banaszynski等,Cell.2006,126(5):995-1004；Iwamoto,Chem Biol.2010,17(9):981-988；Bonger等,Nat Chem Biol.2011,7(8):531-537]。温度控制蛋白质降解的方法最大的缺陷在于温度的改变可能较大程度地改变细胞的表型，因而难以区分表型的改变是由于温度改变引起还是蛋白质降解引起的。

化学小分子控制蛋白质降解的方法有以下几种方法：①化学小分子控制蛋白质泛素的发生进而控制靶标蛋白质降解[Schneekloth等,J Am Chem Soc.2004,126(12):3748-3754Nishimura等,Nature Methods.2009,6(12):917-U978]；②化学小分子控制蛋白质二聚化，引起断裂泛素的重组，进而导致泛素碳端连接的蛋白被切割分离，切割分离下来的蛋白质片段保持稳定，而不含化学小分子的情况下，整个融合蛋白在氮端降解子的作用下降解 [Pratt等,P Natl Acad Sci USA.2007,104(27):11209-11214]；③不稳定的蛋白质在化学小分子作用下保持稳定[Banaszynski等,Cell.2006,126(5):995-1004；Iwamoto,ChemBiol.2010,17(9):981-988]；④稳定的蛋白质在化学小分子诱导下暴露降解肽发生降解[Bonger等,Nat Chem Biol.2011,7(8):531-537]。不过，依赖蛋白质相互作用的方式，需要表达两个复杂的融合蛋白，因此在应用上存在一定的限制。目前真正将蛋白质敲除技术应用于基因功能发现或控制细胞生理的只有③这种方法。小分子化合物改变蛋白质稳定性的过程是一个不可逆过程，尤其是在活体内，小分子化合物的清除严重依赖其代谢的速率。同时该方法不具有空间分辨率。另外，可能要考虑到小分子化合物较高的成本，阻碍了该方法的应用。