[发明专利]利用等位基因特异性PCR技术检测ToMV抗性基因Tm22的方法

权利要求书

1.一种检测抗番茄花叶病毒基因Tm2²的特异性引物，其特征在于所述的特异性引物具有

扩增Tm2²抗性基因特异性引物对为：

Tmfk-g： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAgTA 3′

TmR801:   5′ ctctcaagaacaccatag 3′                   

扩增Tm2²感病性基因特异性引物对为：

 Tmfg-c： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAcGC 3′

 TmR2:     5′TTGATGTTGAAGGTGATATGATGA 3′ 。

2.一种试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物。

3.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒，还包括

模板DNA 20~60 ng，

Taq DNA聚合酶 0.5 U，

dNTPs each 10mmol/L 0.5μL，

10×PCR缓冲液2.5μL，

引物对1：

5^，端引物 10μmol/L  2.5μL，Tmfk-g： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAgTA 3′

   3^，端引物 10μmol/L  2.5μL， TmR801:   5′ ctctcaagaacaccatag 3′                   

引物对2：

 5^，端引物 10μmol/L  2.5μL，Tmfg-c： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAcGC 3′

 3^，端引物 10μmol/L  2.5μL，TmR2:     5′TTGATGTTGAAGGTGATATGATGA 3′。

4. 权利要求2-3任一项所述的试剂盒在用于检测抗番茄花叶病毒基因Tm2²方面的应用。

5.一种利用等位基因特异性PCR技术检测ToMV抗性基因Tm2²的方法，其特征在于按如下的步骤进行： 

（1）基因组DNA提取：从叶片中提取基因组总DNA，按CTAB法提取；

（2）引物的设计：

以植物总DNA为模板，设计特异性引物，对病毒DNA-A进行PCR扩增，其中：

扩增Tm2²抗性基因特异性引物对为：

Tmfk-g： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAgTA 3′

TmR801:   5′ ctctcaagaacaccatag 3′                   

扩增Tm2²感病性基因特异性引物对为：

 Tmfg-c： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAcGC 3′

 TmR2:     5′TTGATGTTGAAGGTGATATGATGA 3′            

（3）PCR反应体系： 

反应总体积为25μL，包括模板DNA 20~60 ng，Taq DNA聚合酶 0.5 U，dNTPs(each 10mmol/L) 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，5^，端引物（10μmol/L）2.5μL，3^，端引物（10μmol/L ）2.5μL，PCR反应条件为：95℃热启动之后，进行PCR扩增；循环条件为：95℃变性5 min，95℃ 30 s，退火54℃30 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃过度延伸10 min，将所有反应物混匀后，于PCR仪上扩增（MJ PTC-200），PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。