[发明专利]利用等位基因特异性PCR技术检测ToMV抗性基因Tm22的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物保护技术，涉及番茄花叶病抗性基因的检测方法，更具体的说是一种快速、简捷、经济的抗番茄花叶病毒基因Tm2²的检测方法。 

背景技术

番茄花叶病是世界性的番茄病害, 分布极其广泛, 危害十分严重。主要症状表现为花叶、蕨叶、矮化、黄化、坏死等症状。一旦发病，就会迅速传播蔓延, 给生产造成不可估量的损失。随着人们对番茄与TMV之间关系的深入研究。发现番茄属里可供番茄育种工作者使用的抗TMV基因主要有三个：Tm-1、Tm-2、Tm2²(Tm-2ａ)，其中来源于番茄种质资源I. P. 128650 ( L .chilense) 的变异株的Tm-2²基因对不同株系均表现高抗性。针对这一基因Dax等人已开发出一个SCAR标记。本研究就是在该标记的基础上，利用等位基因特异性PCR方法开发出一种费用低廉的PCR方法检测Tm2²。该方法不需PCR后的酶切，只需一步PCR就可检测出Tm2²基因。本方法可加快抗病育种进程，对推进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。 

发明内容

目前Tm2²基因的SCAR标记检测方法中需要进行PCR和限制性内切酶酶切等步骤。针对该方法检测成本高昂，检测时间太长等缺点，发明人进行了大量的研究工作，通过基因克隆和测序确定了抗感品种中的基因差异，利用等位基因特异性PCR的方法建立了Tm2²基因的检测体系。此方法无酶切、操作简单是一种成本低且简单方便的Tm2²基因检测的新方法。 

为实现上述目的，本发明提供了一种简便的抗性基因检测方法，通过该方法能科学高效准确地检测出番茄中Tm2²基因。 

本发明的内容如下： 

一种检测抗番茄花叶病毒基因Tm2²的特异性引物，其特征在于所述的特异性引物具有

扩增Tm2²抗性基因特异性引物对为：

Tmfk-g： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAgTA 3′

 TmR801:   5′ ctctcaagaacaccatag 3′                   

扩增Tm2²感病性基因特异性引物对为：

      Tmfg-c： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAcGC 3′

      TmR2:     5′TTGATGTTGAAGGTGATATGATGA 3′            

本发明进一步公开了一种试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括：

模板DNA 20~60 ng，

Taq DNA聚合酶 0.5 U，

dNTPs each 10mmol/L 0.5μL，

10×PCR缓冲液2.5μL，

引物对1：

5^，端引物 10μmol/L  2.5μL，Tmfk-g： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAgTA 3′

   3^，端引物 10μmol/L  2.5μL， TmR801:   5′ ctctcaagaacaccatag 3′                   

引物对2：

  5^，端引物 10μmol/L  2.5μL，Tmfg-c： 5′CCATGAGTAGTTCAACCCAcGC 3′

   3^，端引物 10μmol/L  2.5μL，TmR2:     5′TTGATGTTGAAGGTGATATGATGA 3′            

用双蒸水补足25μL。

本发明更进一步公开了试剂盒在用于检测抗番茄花叶病毒基因Tm2²方面的应用。 

本发明还公开了利用等位基因特异性PCR技术检测ToMV抗性基因Tm2²的方法，其特征在于按如下的步骤进行： 

（1）基因组DNA提取：从叶片中提取基因组总DNA（王关林，植物基因工程，第2版，北京：科学出版社，2002）。

（2）引物的设计： 

以植物总DNA为模板，设计特异性引物，对病毒DNA-A进行PCR扩增，其中：