[发明专利]一种厌氧真菌乙酰酯酶活性的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种厌氧真菌乙酰酯酶活性的快速检测方法。

背景技术

乙酰酯酶(Acetyl esterase，EC3.1.1.6)，由于其含量较低，且适宜的底物也相对较少，因而该酶的研究相对晚于其他酯酶。1985年首次报道乙酰酯酶后，目前该酶已受到越来越多的重视。乙酰酯酶能够水解释放出乙酰化木聚糖中木糖残基C-2和C-3位上的O-乙酰取代基团。在植物的细胞壁中广泛存在着一些连接乙酰基的木糖聚合物(大约每10个木糖残基就有7个被乙酰化)，这些具有乙酰取代基团的木糖聚合物提高了细胞壁的完整性，增加了细胞壁的刚度和强度，降低了细胞壁的降解性。乙酰取代基团在木聚糖酶降解木聚糖过程中具有很强的阻碍作用，而乙酰酯酶能够很好的消除这种阻碍，从而显著提高木聚糖酶对木聚糖的亲和力和降解能力。在饲料工业中，利用乙酰酯酶处理植物性的原材料，可将乙酰基从植物细胞壁的结构中游离出来，从而破坏细胞壁的骨架结构，使得饲料更容易被牲畜消化吸收，可显著提高饲料的利用效率。可见，乙酰酯酶具有广阔的应用前景。

自然界中产生酯酶的微生物主要是真菌，如青霉、黑曲霉、黄曲霉和酵母菌等，其次是细菌，如假单胞菌、粘质赛氏杆菌、无色杆菌和葡萄球菌等。研究表明反刍动物厌氧真菌也能够分泌乙酰酯酶，而且酯酶活性相对较高。因此，从厌氧真菌中分离筛选乙酰酯酶将是研究的一个趋势。目前关于半纤维素酶系的研究集中于降解半纤维素主链的木聚糖酶和β-1，4-木糖苷酶，而对降解侧链的乙酰酯酶研究较少。

目前，测定乙酰酯酶的方法是首先将适当稀释的粗酶液、2mM p-硝基苯乙酯和50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH7.0)置于39℃预热15min，然后向50μL粗酶液中加入100μL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液和50μL底物，39℃反应30min后，用酶标仪680XR(Bio-rad，美国)在415nm下检测吸光值，根据p-硝基苯的标准曲线计算乙酰酯酶活性。但根据发明者的研究表明，厌氧真菌乙酰酯酶在pH9.0和50℃下具有较高的活性，因此，建议厌氧真菌乙酰酯酶活性测定方法修改成将待测酶液和甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH9.0)置于50℃预热15min，然后向待测酶液中加入底物p-硝基苯乙酯，50℃反应30min，用酶标仪在415nm下检测反应30min时的吸光值，根据p-硝基苯的标准曲线计算乙酰酯酶活性。

现有微生物的乙酰酯酶活性都相对较低，因此目前测定乙酰酯酶活性的方法误差相对较大。鉴于从厌氧真菌中分离筛选乙酰酯酶将是研究的一个趋势，优化针对厌氧真菌乙酰酯酶的活性测定方法成为饲料工业尚待解决的重要问题。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种厌氧真菌乙酰酯酶活性的快速检测方法，该方法测定乙酰酯酶活性是在最优条件下测得，所以减少了乙酰酯酶活性测定的误差。其具体技术方案为：

一种厌氧真菌乙酰酯酶活性的检测方法，包括以下步骤：

将待测液在1000×g离心10min，取上清液测定乙酰酯酶活性，将适当稀释的上清液、2mM p-硝基苯乙酯和50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液置于50℃预热15-30min，然后向50μL适当稀释的上清液中加入100μL甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液和50μL p-硝基苯乙酯溶液于干燥洁净的96孔酶标板上，50℃反应15-30min后，用全自动酶标仪在410-420nm下检测吸光值，根据p-硝基苯的标准曲线计算乙酰酯酶活性。

进一步优选，所述预热时间为15min。

进一步优选，所述反应时间为30min。

进一步优选，所述全自动酶标仪检测波长为415nm。

进一步优选，所述缓冲液为pH9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，配制方法为：称取0.7505g甘氨酸，用去离子水充分溶解，并定容至50mL，称取0.4g氢氧化钠，用去离子水充分溶解，并定容至50mL，用去离子水稀释使其浓度为50mM，甘氨酸和氢氧化钠按照17∶3的比例配制使用。

进一步地，所述2mM p-硝基苯乙酯溶液的配制方法为：准确称取0.3623g p-硝基苯乙酯标准品溶于800mL去离子水中，然后定容至1L。

进一步地，乙酰酯酶的1个酶活力单位(U)可被定义为在上述酶促反应条件下，1mL检测液在1min内自标准底物p-硝基苯乙酯中释放1μM p-硝基苯所需的酶量。