[发明专利]一种S-雌马酚产生工程菌及应用

权利要求书

1.一种S-雌马酚产生工程菌，其特征在于所述工程菌是将来源于乳酸菌(Lactococcus sp.)20-92的L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR和L-THDR基因克隆至大肠杆菌BL21(D3)，转化得到S-雌马酚产生工程菌；所述L-DDRC的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示、L-DZNR的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示、L-DHDR的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示，L-THDR的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示。

2.一种权利要求1所述S-雌马酚产生工程菌在制备S-雌马酚中的应用，其特征在于所述的应用为：以大豆素或豆粕为底物，将S-雌马酚产生工程菌经扩大培养获得的种子液以体积浓度5％的接种量接种至BHI培养基或LB培养基，在好氧或厌氧条件下，37℃培养24h，向培养液中加入终浓度25mg/L的IPTG，37℃继续培养6～72h后，取培养液分离纯化，获得S-雌马酚；所述BHI培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L、脱水小牛脑浸粉12.5g/L、脱水牛心浸粉5.0g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、磷酸氢二钠2.5g/L，溶剂为水，pH值为7.0；所述LB培养基终浓度组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10g/L，溶剂为水，pH值为7.0。

3.如权利要求2所述S-雌马酚产生工程菌在制备S-雌马酚中的应用，其特征在于所述大豆素的初始浓度为50μg/ml。

4.如权利要求2所述S-雌马酚产生工程菌在制备S-雌马酚中的应用，其特征在于所述豆粕的初始浓度为15g/L。

5.如权利要求2所述S-雌马酚产生工程菌在制备S-雌马酚中的应用，其特征在于所述的应用按如下步骤进行：(1)种子培养：将S-雌马酚产生工程菌接种至含有终浓度50μg/ml羧苄青霉素和终浓度50μg/ml链霉素的BHI培养基中，37℃静置，厌氧培养24h后，获得种子液；(2)发酵培养及转化反应：将大豆素或豆粕加入BHI培养基或LB培养基，然后以体积浓度5％的接种量接种种子液，在好氧或厌氧条件下，37℃培养24h，向培养液中加入终浓度25mg/L的IPTG，37℃继续培养6～72h后，取培养液分离纯化，获得S-雌马酚；所述大豆素的初始浓度为50μg/ml，所述豆粕的初始浓度为15g/L。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述培养液分离纯化的方法为：取1ml的培养液，8000r/min离心3分钟，获得上清a；取900μl上清a至另一干净的2ml EP管中，然后向管中加入900μl乙酸乙酯，充分混匀后静置5min，5000r/min离心5分钟，获得上清b和沉淀b；取900μl上清b至另一干净的2ml EP管中；取沉淀b加入等量的乙酸乙酯重复离心1次，获得上清c；将上清b和上清c混合在一起，移到2ml离心管中，45℃真空冷冻浓缩成粉末；加入200μl无水甲醇到该EP管溶解浓缩粉末，并经0.22μm聚偏氟乙稀微孔滤膜过滤，滤液即为S-雌马酚。