[发明专利]一种S-雌马酚产生工程菌及应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种工程菌的构建及应用，特别涉及一种来源与乳酸菌的S-雌马酚产生工程菌及将大豆素或豆粕转化为S-雌马酚的应用。

(二)背景技术

大豆异黄酮具有多种生物学功能，从1980年起，大量医学研究表明，大豆异黄酮除与雌激素受体结合，从而有效地预防骨质疏松、乳腺癌、子宫内膜癌外，还能与雄激素受体结合减少前列腺癌的发生，并具有抗氧化、抗溶血和抗真菌活性等。在动物生产上，国内外大量研究表明大豆异黄酮可以促进雄性动物生长，增强机体免疫，改善动物产品品质，提高生产性能等。但大豆异黄酮的生物学作用在一定程度上归因于其代谢产物雌马酚，人体能否将大豆黄素代谢为雌马酚是决定大豆异黄酮能否更有效地发挥其降低肿瘤、心血管疾病、骨质疏松以及更年期综合症等慢性疾病风险作用的关键因素。因此雌马酚的作用受到普遍关注，成为目前生物学研究的热点之一。雌马酚是大豆异黄酮重要的代谢产物，人群中约有30％～50％的人能将大豆异黄酮转化成雌马酚进而排泄，但影响其转化的因素目前尚不完全清楚，其中肠道菌群可能是最重要的因素。

异黄酮类化合物在天然大豆中主要以结合了糖基的糖苷大豆异黄酮方式存在，即糖苷大豆黄酮(daidzin)和糖苷染料木素(genistin)。在哺乳动物体内，糖苷形式的大豆异黄酮不能直接经小肠壁吸收，因此没有生理活性。而去除糖基配体后形成的中间代谢产物大豆黄酮苷元(daidzein)和染料木素苷元(genistein)等也只表现出弱雌激素样活性。只有由肠道细菌特异性降解后产生的代谢终产物--雌马酚才具有较高的生物学活性。与大豆黄酮苷元相比，雌马酚与雌激素受体结合的亲和力、抗氧化活性、抗前列腺癌作用更强，而在血浆中的清除速度更慢。因此大豆异黄酮的生物活性更多的是由其代谢终产物雌马酚来实现的。

目前生产雌马酚的主要方法为化学合成，其存在的两个问题就是：(1)肠道菌代谢产生的雌马酚都是S-型的，具有生物活性；而以大豆黄素为原料化学合成的雌马酚是R-雌马酚和S-雌马酚混合的外消旋化合物，R-雌马酚是没有活性的；(2)化学合成需要金属催化剂、氢气、高压高温等，对生产设备要求高，产量低，成本也比较高。所以能否采用生物法合成雌马酚成为大家关注的热点。对现有技术的文献检索发现，目前与本发明密切相关的专利有“不动杆菌AUH-JLM455及其转化制备S-雌马酚的方法”(申请号：200810147314.9)，“雌马酚产生菌及利用”(申请号：201080007863.1)，“含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物”(申请号：200480020952.4)，“含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物的发酵制品及其制备方法”(申请号：200980136848.4)，“一种奇异变形杆菌菌株及其转化大豆苷元生产S-雌马酚的方法”(申请号：201210146746.4)，“一种屎肠球菌及其产生雌马酚的方法与应用”(申请号：201110086803.X)，和“一株降解大豆苷原产生雌马酚的双酶梭菌及其菌剂和应用”(申请号：201010513344.4)。以上这些专利均是使用从肠道中分离获得的单一或少数几种细菌混合厌氧发酵生产雌马酚，但研究发现分离到的这些细菌大部分是细菌新种，而且不同的培养基成分和发酵条件会影响其是否能产生雌马酚，再加上厌氧培养等要求较高，所以采用原始分离菌厌氧发酵生产雌马酚的方法不仅费时费力，还有可能因为培养基成分和培养条件的原因而影响雌马酚产量和发酵成本。

(三)发明内容

本发明针对目前生物学方法生产S-雌马酚的局限性，构建了一种操作简单、稳定有效、发酵条件简单的S-雌马酚产生工程菌。并利用此工程菌对S-雌马酚的生产能力进行了验证与应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种S-雌马酚产生工程菌，所述工程菌是将来源于乳酸菌(Lactococcus sp.)20-92的L-DDRC、L-DZNR、L-DHDR和L-THDR基因克隆至大肠杆菌BL21(D3)，转化得到S-雌马酚产生工程菌；所述L-DDRC的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示、L-DZNR的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示、L-DHDR的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示，L-THDR的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示。

进一步，本发明所述S-雌马酚产生工程菌按如下方法构建：