[发明专利]栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。

背景技术

压疮、糖尿病足、烧伤及慢性伤口内存在很多失活组织。失活组织是机会性感染的优良培养基，会阻碍伤口的愈合。因此有效的清创是必要的。目前临床上最常用的清创方式仍是手术清创。除此之外，还有采用蛋白水解酶的酶清创。酶清创可以将坏死或失活的组织分解清除，同时又不损害邻近正常组织，从而达到清创目的。己有描述将枯草菌蛋白酶、胶原酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶及链激酶作为清创剂。但这些清创酶各有优缺点，并且早期清创效果尚未能完全令人满意。

己发现栖土曲霉能够产生水解能力很强的栖土曲霉中性蛋白酶。但把栖土曲霉蛋白酶作为伤口清创酶并未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种清创能力强、副作用小，并且制备工艺简单、产量高的栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。

本发明的技术解决方案是：

一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。

所述伤口为烧伤伤口、压疮伤口、慢性感染伤口或糖尿病足伤口。

所述栖土曲霉蛋白酶由下列步骤制得：

(1)培养基的制备

发酵培养基配比为：麸皮3％、米糠1％、玉米粉1％、KH₂PO₄0.4％，加水至100％，并于120℃下高温灭菌30分钟；

(2)粗酶液的制备液

将栖土曲霉3.942菌种按培养基8％的重量接种后，在250r/min振荡器中30℃下培养72小时；终止培养后，将发酵培养物于离心机中3000r/min离心10分钟，取上清液即为粗酶液；

(3)栖土曲霉蛋白酶的分离

粗酶液过滤，滤液调节pH至7.0，加入20％浓度的单宁酸，边加边搅拌；单宁酸用量为粗酶液重量的1％；待沉淀完全后离心，收集沉淀；沉淀用pH7.2、0.02M磷酸缓冲液溶解；使用聚乙二醇洗脱单宁酸，在搅拌下加入10％浓度的PEG，使PEG与单宁酸之比值达到3:1ml/g；离心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，静置过夜，离心，收集沉淀；沉淀再浸泡于冷丙酮，静置过夜，然后过滤，沉淀用乙醚再洗涤一次，干燥即得栖土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制剂；

(4)栖土曲霉蛋白酶的纯化

上述丙酮粉粗酶用pH8.4、0.05M Tris‐HCL缓冲液溶解，上DEAE‐Sephadex A‐25柱，然后用平衡缓冲液洗涤；层析共分离出7个峰，酶活力存在于P2峰内；收集P2峰，对水于低温下透析至无盐止，再用PEG脱水浓缩后，冷冻干燥。

(5)蛋白酶活力的测定

采用福林酚法测定蛋白酶活力。酶活定义为在40℃，适当的PH条件下，1分钟内水解酪蛋白产生1微克酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位。测得栖土曲霉蛋白酶冷干粉的酶活力为1.1×10⁵U/g。

本发明由栖土曲霉获得的能够对无活力组织进行伤口清创的蛋白酶，清创能力强、副作用小，并且制备工艺简单、产量高。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

栖土曲霉蛋白酶的制备

(1)培养基的制备

发酵培养基配比为：麸皮3％、米糠1％、玉米粉1％、KH₂PO₄0.4％，加水至100％并于120℃下高温灭菌30分钟。

(2)粗酶液的制备液

将栖土曲霉3.942菌种按培养基8％的重量接种后，在250r/min振荡器中30℃下培养72小时。终止培养后，将发酵培养物于离心机中3000r/min离心10分钟，取上清液即为粗酶液。

(3)栖土曲霉蛋白酶的分离

粗酶液过滤，滤液调节pH至7.0。加入20％质量浓度的单宁酸，边加边搅拌。单宁酸用量为粗酶液重量的1％。待沉淀完全后离心，收集沉淀。沉淀用pH7.2、0.02M磷酸缓冲液溶解。使用聚乙二醇(PEG)洗脱单宁酸。在搅拌下加入10％质量浓度的PEG，使PEG(ml)与单宁酸(g)之比值达到3:1。离心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，静置过夜，离心，收集沉淀。沉淀再浸泡于冷丙酮，静置过夜，然后过滤，沉淀用乙醚再洗涤一次，干燥即得栖土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制剂。

(4)栖土曲霉蛋白酶的纯化