[发明专利]一种用于快速检测甘蔗黑穗病菌的LAMP引物组、试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种快速检测甘蔗黑穗病菌的LAMP引物组、试剂盒及其检测方法。

背景技术

由甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）引起的甘蔗黑穗病是一种世界性重要甘蔗病害，也是我国一种经济危害性最严重的甘蔗病害，其主要传播途径是在种苗或种茎带有甘蔗黑穗病菌，甘蔗黑穗病菌在甘蔗存放和种植过程中扩散传染。甘蔗黑穗病最典型的症状是蔗茎生长点变异产生黑色鞭状物，是甘蔗病害中最容易诊断的病害，但其发病潜伏期较长，早期无症状的甘蔗小苗或甘蔗种茎一般方法难以准确诊断其是否感染或携带甘蔗黑穗病。因此，探索其快速检测技术对甘蔗引种检疫、病害早期诊断及抗病品种快速筛选等及其重要。

目前，对于甘蔗黑穗病已建立的检测方法有：分生组织染色技术（Nallathambi P, Padmanaban P, Mohanraj D. Histological staining: an effect method for sugarcane smut screening [J]. Sugar Cane, 1998(2):10-13）、ELISA快速检测技术（Nallathambi P, Padmanaban P, Mohanraj D. Standardization of an indirect ELISA technique for detection of u.scitamineasyd., causal agent of sugarcane smut disease [J]. Journal of Mycology and Plant pathology, 2001, 31(1):76-78）；PCR检测技术等。

随着分子生物技术的发展，PCR检测技术也得到的广泛的应用，专利号为201010230534.5的发明专利公开了一种甘蔗黑穗病菌快速检测方法，该方法使用真菌ITS通用引物，其检测特异性极差，灵敏度有限，在黑穗病菌感染量小时无法准确检测出；专利号为201110218585.0的发明专利公开了一种甘蔗黑穗病菌巢式PCR快速检测方法，这种PCR检测方法主要包括以下步骤：步骤1：采用CTAB法提取甘蔗黑穗病菌基因组总DNA；步骤2：以甘蔗黑穗病菌基因组总DNA为模板，采用真菌核糖体基因转录间隔区ITS的通用引物ITS4和ITS5进行第一轮PCR扩增；步骤3：以第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液为模板，采用甘蔗黑穗病菌核糖体基因转录间隔区ITS的特异引物Smut-L1和Smut-R2经过PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物；步骤4：对第二轮PCR扩增产物进行凝胶电泳分析。这种方法虽然能检测出甘蔗是否感染黑穗病菌，但该方法要经过两轮PCR扩增，需要PCR仪、电泳仪及凝胶成像系统等昂贵的专业仪器及分子生物学专业实验人员操作，限制了该检测方法的推广应用。

环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本学者Notomi等（2000）发明的一种新型体外等温扩增特异核酸判断的技术（Notomi T, Okayama H, Masubuchi H et al.,2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research, 28(12): e63），随着LAMP技术的发展，已成功应用LAMP技术检测病毒、细菌、真菌以及寄生虫等病原的检测（刘永生，丁耀忠，张杰。环介导等温扩增（LAMP）技术的应用研究[J]，2010,26（8）：87-89）。

LAMP法具有特异性强，快速、高效，敏感性高，操作简便，检测方法简单等优点，肉眼即可判断结果，从而简化了检测过程，检测时间也大大缩短。目前尚未见应用LAMP技术用于检测甘蔗黑穗病菌的相关技术报道。

发明内容

本发明针对现有技术中甘蔗黑穗病菌检测方法存在成本高、特异性低、步骤繁琐、易污染等缺点，提供一种用于快速检测甘蔗黑穗病菌的LAMP引物组。

本发明的第二个目的是提供一种快速检测甘蔗黑穗病菌的LAMP试剂盒。

本发明的第三个目的是提供一种快速检测甘蔗黑穗病菌的LAMP检测方法。     

本发明所述引物组或试剂盒特异性的检测甘蔗黑穗病菌，所述检测方法具有成本低、易操作、简单、快速、特异性强，灵敏度高等特点，适合于基层农技部门对甘蔗黑穗病菌的田间快速检测。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：