[发明专利]一种快速石蒜转基因的方法

权利要求书

1.石蒜的转基因方法，其特征在于： 

A外植体消毒：选取多年生石蒜的鳞茎洗净，剥去外层鳞片，切除根部，切去鳞茎上半部分约1/2～2/3。将留有鳞茎盘的鳞茎均分为4～8块，用0.1％的安利洗涤液在摇床上震荡洗涤15～20min，流水冲洗30～60min后，再在超净工作台上用75％的酒精漂洗30s，无菌水清洗4遍后，用含1％的次氯酸钠，无菌水冲洗4-5遍，最后用无菌滤纸吸干表面水分； 

B愈伤诱导：将消毒过的小块鳞茎接种到以下培养基中：MS基本培养基添加0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤和0.1～5.0mg/L-二氯苯氧乙酸和浓度为0.1～3.0mg/L激动素，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下进行光照培养30～40天； 

C农杆菌侵染：石蒜与农杆菌共培养用液体培养基悬浮制成携有目的基因的农杆菌菌液浸泡石蒜愈伤组织20-60min，进行侵染，取出愈伤组织，接种于相应培养基上，再在22-26℃的条件下，进行侵染2-4天；所述石蒜愈伤农杆菌共培养液体培养基是在MS基本培养基上添加了浓度为0.5～7.0mg/L的6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素，浓度为180-220μM的乙酰丁香酮，质量百分比浓度为0.8-1.2％的葡萄糖，浓度为0.08-0.12g/L的干酪素水解物； 

D恢复培养：将农杆菌侵染后的石蒜愈伤组织置于不添加筛选剂的恢复培养基上，再在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下恢复培养6-14天；所述不添加筛选剂的恢复培养基是在MS基本培养基基础上添加浓度为0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素和对农杆菌具有致死作用的抗生素； 

E抗性筛选：将恢复培养的转基因愈伤组织转接至特定抗性的培养基上，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下培养10-20天，进行转基因愈伤组织的筛选；所述特定抗性培养基是MS基本培养基上添加浓度为0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素和所转载体携有的抗性如卡那霉素抗性； 

F转基因石蒜愈伤组织的再生：一次抗性筛选后的愈伤组织转接至丛生芽诱导筛选培养基上，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下培养30-40天，进行丛生芽诱导与筛选；进一步将获得丛生芽转接于生根筛选培养基上，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下培养20-30天，进行生根诱导与筛选，所述丛生芽诱导筛选培养基是在MS培养基基础上添加浓度为0.5～7.0mg/L的6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～3.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸和所转载体携有的抗性；所述生根诱导筛选培养基是在MS培养基基础上添加浓度为0.1～5.0mg/L的萘乙酸和所转载体携有的抗性。 

2.根据权利要求1所述石蒜的转基因方法，其特征在于步骤A中的种子消毒用试剂0.1％的安 利洗涤液在摇床上震荡洗涤15～20min和1％次氯酸钠灭菌30～60min。 

3.根据权利要求1所述的石蒜的转基因方法，其特征在于步骤B中所涉及到的pH值范围为5.8～7.0。