[发明专利]一种快速石蒜转基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种石蒜的转基因方法，属于植物改良和新品种开发技术领域。

背景技术

石蒜(Lycoris radiata)是观赏价值较高的一类草本花卉，具有花色鲜艳、花姿独特及花后观叶等特点，广泛应用于园林地被绿化及鲜切花生产。而且石蒜所含的特有生物碱还具有重要的药理价值。研究表明石蒜生物碱具有抗癌、消炎和胆碱酯酶抑制剂的作用，已被广泛应用于临床治疗。但石蒜中重要生物碱的含量很低，不能满足日益扩大的需求，而且过度采集严重破坏石蒜野生资源。因此，提高石蒜植株中重要生物碱的含量是当前石蒜开发利用迫切需要解决的问题。石蒜是我国石蒜属植物中分布范围最广、适应性最强的一个种，但是石蒜染色体核型为3倍体，不能通过常规的杂交手段来改良品质；而且即使是可以种子繁殖的其他石蒜属植物，从种子苗到开花至少需要3-4年，杂交育种周期很长。因此，石蒜转基因技术体系的建立，不仅是石蒜改良的必由之路，而且对于其他石蒜属植物的改良也具有高效优势，能够大大缩短育种进程。尽管石蒜组织培养及快繁技术已经成熟，愈伤组织诱导也有报道，但关于石蒜的转基因方法尚未见报道，而且石蒜属中也尚未有关于转基因方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用农杆菌介导法培育转基因石蒜的方法，为提高石蒜重要生物碱含量、改良石蒜观赏品质及相关依赖于转基因技术的基础研究提供技术支撑，同时对于石蒜属其他植物转基因方法的建立具有重要的借鉴意义。

本发明所提供的转基因技术，可包括以下步骤：

A外植体处理：选取多年生石蒜的鳞茎洗净，剥去外层鳞片，切除根部，切去鳞茎上半部分约1/2～2/3。将留有鳞茎盘的鳞茎均分为4～8块，用0.1％的安利洗涤液在摇床上震荡洗涤15～20min，流水冲洗30～60min后，再在超净工作台上用75％的酒精漂洗30s，无菌水清洗4遍后，用含1％的次氯酸钠，无菌水冲洗4-5遍，最后用无菌滤纸吸干表面水分；

B愈伤组织诱导：将灭过菌的小块鳞茎接种到愈伤诱导培养基中，配方如下：MS基本培养基中添加0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸和浓度为0.1～3.0mg/L激动素，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下进行光照培养30～40天；

C农杆菌侵染：石蒜与农杆菌共培养用液体培养基悬浮制成携有目的基因的农杆菌菌液浸泡石蒜愈伤组织20-60min进行侵染，取出愈伤组织，接种于相应培养基上，再在22-26℃的条件下，进行侵染2-4天；所述石蒜愈伤农杆菌共培养液体培养基是在MS基本培养基上添加了浓度为0.5～7.0mg/L的6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素和浓度为180-220μM的乙酰丁香酮，质量百分比浓度为0.8-1.2％的葡萄糖，浓度为0.08-0.12g/L的干酪素水解物；

D恢复培养：将农杆菌侵染后的石蒜愈伤组织置于不添加筛选剂的恢复培养基上，再在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下恢复培养6-14天；所述不添加筛选剂的恢复培养基是在MS基本培养基上添加浓度为0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素和对农杆菌具有致死作用的抗生素；

E抗性筛选：将恢复培养的转基因愈伤组织转接至特定抗性的培养基上，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下培养10-20天，进行转基因愈伤组织的筛选；所述特定抗性培养基是MS基本培养基上添加浓度为0.5～7.0mg/L6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～5.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，浓度为0.1～3.0mg/L激动素和所转载体携有的抗性如卡那抗性；

F转基因组织GUS染色鉴定：将抗性筛选后的愈伤组织和未转基因的对照愈伤组织，通过X-Gluc染色后，显微镜观察；

G转基因石蒜愈伤组织的再生：一次抗性筛选后的愈伤组织转接至丛生芽诱导筛选培养基上，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下培养30-40天，进行丛生芽诱导与筛选；将获得丛生芽转接于生根筛选培养基上，在22-26℃、光照10-16小时/天的条件下培养20-30天，进行生根诱导与筛选；所述丛生芽诱导筛选培养基是在MS培养基上添加浓度为0.5～7.0mg/L的6-卞基腺嘌呤，浓度为0.1～3.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸和所转载体携有的抗性；所述生根诱导筛选培养基是在MS培养基上添加浓度为0.1～5.0mg/L的萘乙酸和所转载体携有的抗性；