[发明专利]一种利用PMI筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法

权利要求书

1.一种利用PMI筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

步骤1：分离出水稻种子的胚，并置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

步骤2：将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养；

步骤3：将所述步骤2中获得的愈伤组织与携带磷酸甘露糖异构酶PMI(phosphomannose isomerase)筛选标记基因的农杆菌接触第一预定时间段；

步骤4：将步骤3处理后的愈伤组织转移到农杆菌悬浮培养基，培养第二预定时间段；

步骤5将步骤4处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养第三预定时间段；

步骤6将步骤5处理后的愈伤组织转移至筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

步骤7将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

步骤8将所述苗转移到生根培养基中生根。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PMI标记基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述步骤4中采用垫有若干无菌滤纸的培养皿，所述无菌滤纸中加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基，所述农杆菌悬浮培养基中[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝40mM/10mM；和/或

所述筛选培养基中[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝40mM/10mM，并且所述筛选培养基含有5g/L蔗糖和10g/L甘露糖；和/或

所述分化再生培养基中[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝40mM/10mM，并且含有1.5mg/L萘乙酸(NAA)和1mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA)；和/或

所述生根培养基中含0.4mg/L的NAA。

4.根据权利要求1的方法，其特征在于，

所述诱导培养基包括预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L2,4-D、3g/L植物凝胶；和/或

所述步骤3中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在农杆菌悬浮液中；和/或

所述农杆菌悬浮培养基包括：预定配比的N6大量元素([NO₃^-]/[NH₄⁺]＝40mM/10mM)、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、100μmol/L乙酰丁香酮；和/或

所述前筛选培养基包括：预定配比的N6大量元素([NO₃^-]/[NH₄⁺]＝40mM/10mM)、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L2,4-D、3g/L植物凝胶、250mg/L羧苄青霉素；和/或

所述筛选培养基包括：预定配比的N6大量元素([NO₃^-]/[NH₄⁺]＝40mM/10mM)、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、5g/L蔗糖、10g/L甘露糖、2mg/L2,4-D、250mg/L羧苄青霉素、3g/L植物凝胶；和/或

所述分化再生培养基包括预定配比的N6大量元素([NO₃^-]/[NH₄⁺]＝40mM/10mM)、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、1g/L CH、30g/L蔗糖、30g/L山梨醇、500mg/L2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、2.5mg/L CuSO₄、1.5mg/L NAA、1mg/L6-BA、AA氨基酸、125mg/L羧苄青霉素、2.5g/L植物凝胶；和/或

所述生根培养基包括1/2MS(Murashige&Skoog)基础盐(2.l65g/L)、MS维生素、20g/L蔗糖、0.4mg/L NAA、125mg/L羧苄青霉素、3.5g/L植物凝胶。