[发明专利]一种利用PMI筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种利用PMI筛选标记，将外源基因导入到闭颖授粉粳稻品种8m30的遗传转化方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国乃至世界上最重要的粮食作物，世界上60％以上的人口以稻米为主食。近年来面对日益频繁的干旱、极端温度等非生物胁迫的影响，人口增长和生态环境的压力，现代生物技术手段，特别是转基因技术在作物遗传改良方面的重要性日渐凸显。转基因技术为农作物的产量提升、品质改良和抗性增强提供了新路径、开拓了新空间。

随着转基因作物的种植范围迅速扩大，转基因作物及其产品的安全性，引起了广泛关注。例如转基因品种花粉外传会带来基因漂移，可能产生“超级杂草”等风险，但目前由于缺乏实用有效的技术手段加以克服，比如物理隔离需要一定的空间阻止花粉传播(水稻需在100m以上)，只适于小面积实验，在大面积生产中是不切实际的。而闭颖授粉品种在整个授粉过程中，颖花不张开，花药不外露，花粉不会向外传播，可以有效抑制花粉外传，避免基因污染。通过闭颖受体来解决基因污染问题，是目前被认为最可行的技术手段，但目前生产还缺乏实用化的闭颖水稻品种。本实验室创制的8m30等闭颖授粉粳稻品种，不仅完全闭颖授粉，而且结实率、株高等重要农艺性状较好，可作为理想的转基因受体应用于品种快速遗传改良，减少生态风险。

现有转基因作物的转化方法，主要使用抗生素抗性基因作为筛选标记，该类基因可能随食物进入肠道,存在与肠道微生物基因交换产生耐药菌株的潜在风险，以致影响抗生素的医用效果。为了替代抗生素抗性基因，其他类型筛选标记基因被陆续研究开发，如除草剂抗性基因、氨基酸代谢筛选基因、可视标记基因，但这些筛选标记基因要么存在类似问题，要么筛选效率和成本不适于规模化应用。而PMI是一种糖代谢基因，广泛存在于藻类和一些豆科植物中。水稻等高等植物细胞虽能将甘露糖转化为6-磷酸甘露糖，但由于细胞自身缺乏PMI，不能进一步将6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，从而进入糖酵解途径而被利用，因此PMI可以作为筛选标记基因。与抗生素、除草剂等负选择不同，甘露糖是进行正选择，转化的细胞表达PMI基因，可以利用甘露糖为碳源而正常生长，筛选效率高。同时，甘露糖是广泛存在于海藻、蕨类等植物中的己糖，且PMI的催化产物为6-磷酸果糖，是蜂蜜和果浆的主要成份，二者都是环境友好的天然物质。

但目前还没有以PMI作为筛选标记，高效、简便的闭颖授粉水稻品种的遗传转化方法的报道。

发明内容

为充分利用具有闭颖授粉性状的独特遗传资源，同时降低使用抗生素或除草剂抗性基因作为筛选标记的潜在风险，本发明旨在建立一种以PMI作为筛选标记，适用于闭颖授粉粳稻品种的遗传转化方法。

本发明的目的是提供一种以PMI作为筛选标记，将外源基因导入到闭颖授粉粳稻品种8m30的遗传转化方法以及相应制备转基因水稻植株的方法。本发明提供了下列技术方案来实现该目的。

在一个方面，本发明提供一种利用PMI筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

步骤1：分离出水稻种子的胚，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

步骤2：将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养；

步骤3：将所述步骤2中获得的愈伤组织与携带磷酸甘露糖异构酶PMI筛选标记基因的农杆菌接触第一预定时间段；

步骤4：将步骤3处理后的愈伤组织转移到农杆菌悬浮培养基，培养第二预定时间段；

步骤5将步骤4处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养第三预定时间段；

步骤6将步骤5处理后的愈伤组织转移至筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

步骤7将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

步骤8将所述苗转移到生根培养基中生根。

在步骤1中，可以先对水稻种子去壳、灭菌后再将胚分离出来。

在一种实现方式中，所述PMI标记基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在一种实现方式中，所述步骤4中采用垫有若干无菌滤纸的培养皿，所述无菌滤纸中加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基，[NO₃^-]/[NH₄⁺]＝40mM/10mM。优选地，垫上三张无菌滤纸在21-23℃条件下培养48小时。