[发明专利]定点引入不配对区域的高效保真PCR方法

权利要求书

1.一种定点引入不配对区域的高效保真PCR方法，通过以下步骤实现：

（1）根据目标基因CDNA序列及所需引入不配对碱基设计引物，其规则为：5’端→3’端：不配对区3’端后有18个碱基及以上的CDNA上游配对区；

（2）取酶用量按理论要求所需最低用量，建立50μ1 PCR体系，按配对碱基数计算PCR退火温度；扩增得到具有与原始模板不配对的区域的第一阶段产物，所述的50μ1 PCR体系为：

cDNA模板: 4.0μl

10×PCR缓冲液: 5.0μl

2.5mM dNTP: 4.0μl

25mM Mg²⁺ ：5.0μl

10pM/10pM上游引物/下游引物：2.0/2.0μl

5U/μl Tag 酶：0.2μl

双蒸水 补足至50μl；

其特征在于，

（3）取第一步产物为模板，模板的体积小于等于第二步骤反应体系的1/10，建立50μ1PCR体系，并根据配对碱基数的增加可相应提高退火温度，按扩增效率选择循环数，以高保真酶扩增得到第二阶段产物，所述的50μ1 PCR体系为：

第一步PCR产物: 4.0μl

10×PCR缓冲液: 5.0μl

2.5mM dNTP: 4.0μl

25mM Mg²⁺ ：2.5μl

10pM/10pM 上/下游引物：2.0/2.0μl

5U/μl Pfu酶：1.0μl

双蒸水 补足至50μl；

其中步骤（1）所述不配对区为特定位点的定向碱基突变，包括含酶切位点的引物区域或点突变区域；步骤（2）选取Tag 酶，进行3-5个循环扩增；步骤（3）取第一步产物为模板，取高保真PCR聚合酶Pfu酶，建立PCR体系。