[发明专利]定点引入不配对区域的高效保真PCR方法

说明书

本发明提供一种定点引入不配对区域的高效保真PCR方法，定点引入不配对区域的高效保真的2步PCR方法，分别使用不同性质的聚合酶,在各自最优化的缓冲体系中进行PCR扩增反应：先使用保真性低而具备高扩增能力的tag酶进行PCR反应，解决引物与模板不配对的问题，得到具有与原始模板不配对的区域（含酶切位点的引物区域或点突变区域）的产物；继而专用高保真Pfu酶以前一步产物为模板，完全匹配地进行扩增，很好解决了这类具不配对区域的PCR反应中的扩增效率与高保真的问题。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及PCR扩增方法，特别是涉及在指定位点引入与模板不配对区域的PCR方法。

背景技术

在定点引入不配对区域的PCR过程中，如引物5’端增加酶切位点的PCR、定点突变是分子生物学中常用技术，对PCR过程有极高的要求：原有配对区要求高保真、而定点不配对区则要求能做到定向突变、产物要求高效扩增。但是在实际操作过程中实验操作者很难做到保真性、特异性突变和效率兼顾； 除了引物设计、退火温度等因素外，PCR过程中所使用的聚合酶及Mg2+浓度也是与特异性、保真性、扩增效率、突变兼容性密切相关的因素。

高扩增效率的低保真PCR聚合酶（热启动酶，如Tag酶，Roche 的fast starTag,等等）—扩增效率高但是突变率高；且突变位点随机，得到和目标产物完全一致的序列几率低，增加测序次数、成本、时间。

高保真酶（具有3’→5’外切酶活性的酶，如promega 公司的Pfu等）—降低碱基错配率，当发生错配时，可将错配碱基切除，保真性高但扩增效率低，在引物与模板有一定的不配对性的情况下而扩增能力更低（表1）。

市售高保真+ 高扩增效率酶（如Roche 的High Fidelity等）：成分往往为混合酶，即热启动酶与具有3’ →5’外切酶活性酶的混合物，部分解决了保真性与高扩增效率的兼容问题。然而，偏重保真性的混合酶中Pfu比例高,而引物不配对区域的存在使其始终发挥着3’ →5’外切酶活性, 且低浓度Mg²⁺大大影响tag的扩增效率，不配对产物的扩增效率远不及tag酶；偏重扩增效率的混合酶中Tag比例上升，出错率高，所用高浓度Mg²⁺也降低了Pfu的特异性。这种混合酶在进行定点引入不配对区域的PCR实验中获得目标基因序列的成功率实际并不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种定点引入不配对区域的高效保真PCR方法，通过以下步骤实现：

1，根据目标基因CDNA序列及所需引入酶切位点设计引物，其规则为：5’端→3’端：不配对区域+18个碱基以上的CDNA上游配对区。

2，选取保真性不高但扩增效率高的低保真PCR聚合酶，酶用量按理论要求所需最低用量，实验体系按其使用说明建立缓冲体系，按配对碱基数计算PCR退火温度，进行3-5个循环 ；此步骤利用Tag酶的兼容性，扩增得到具有与原始模板不配对的区域（含酶切位点的引物区域或点突变区域）的第一阶段产物，此产物量远远多于原始模板。

3，取少量第一步实验产物为模板，取高保真PCR聚合酶，按其使用说明建立实验缓冲体系，并根据配对碱基数的增加可相应提高退火温度，按扩增效率选择循环数,以高保真酶扩增得到第二阶段产物, 如果所取模板体积小于等于第二步骤反应体系的1/10，则第一阶段产物中所含有Mg²⁺及极少量未反应光的低保真酶在此步骤中所占比例小于1/10,所发挥的作用可忽略。

通过以下步骤验证获得的PCR产物：

1，电泳分离并回收相应片段长度的PCR产物，（如需要可将PCR产物配对后再次延伸得到全长目标序列），经限制性内切酶酶切，纯化酶切产物，与经相应酶切的载体进行连接，转化大肠杆菌；

2，每个基因随机取若干个单克隆，扩增；质量抽提、纯化；进行测序鉴定以鉴定目标基因序列的正确性。