[发明专利]单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素

权利要求书

1.一种单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素，其特征在于，其由单个基因编码区域产生，不包含常规抗体的CL和CH1结构域，包含由灵活肽段连结而成的两个或多个抗体功能结构域scFv以及人免疫球蛋白Fc区域，且能够同时与两个或多个不同HIV相关抗原表位进行高亲和力的结合。

2.一种单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：筛选目标基因，并根据目标基因构建中和抗体单链scFv基因；

步骤二：将构建的一种中和抗体单链scFv基因与人hIgG₁-Fc基因进行无缝连接，构成IgG免疫粘附素融合基因；

步骤三：通过重叠PCR的方法将另一种中和抗体单链scFv基因与上述IgG免疫粘附素融合基因通过一个(Gly₄Ser)₄肽段相连接，构建融合基因；

步骤四：将步骤三最后构建得到的融合基因整合进优化后的pVAX-Opt.载体中，构建出单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒pVAX-SG-Bispecific-IA；

步骤五：将构建的单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒pVAX-SG-Bispecific-IA通过细胞转染和蛋白纯化来得到所需的免疫粘附素。

3.根据权利要求2所述的单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素的制备方法，其特征在于，步骤一中所述目标基因为scFv-Hu5A8基因和scFv-PGT128基因，所述构建的中和抗体单链scFv基因序列如图1的scFv-Hu5A8和scFv-PGT128所示。

4.根据权利要求3所述的单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素的制备方法，其特征在于，步骤二中构建的一种中和抗体单链scFv基因为scFv-Hu5A8基因，与人hIgG₁-Fc基因进行无缝连接，构建scFv-Hu5A8-IgG基因，构建方法如下：

先用设计好的两对引物分别PCR扩增scFv-Hu5A8基因和hIgG₁-Fc基因，引物的构建原则为：scFv-Hu5A8基因的反向引物和hIgG₁-Fc基因的正向引物有10个碱基的基因重叠，scFv-Hu5A8基因的正向引物和hIgG₁-Fc基因的反向引物的末端分别设计有BamHI和MssI酶切位点；然后以两种扩增产物为模板，以scFv-Hu5A8基因的正向引物和hIgG₁-Fc基因的反向引物为引物再进行PCR扩增，得到Hu5A8的IgG免疫粘附素融合基因，即scFv-Hu5A8-IgG。

5.根据权利要求4所述的单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素的制备方法，其特征在于，步骤三中另一种中和抗体单链scFv基因为scFv-PGT128基因，构建方法如下：先用设计好的两对引物分别PCR扩增scFv-PGT128基因和scFv-Hu5A8-IgG基因；引物的构建原则为：scFv-PGT128基因的反向引物和scFv-Hu5A8-IgG基因的正向引物有45个碱基的基因重叠，且scFv-PGT128基因的正向引物和scFv-Hu5A8-IgG基因的反向引物的末端分别设计有BamHI和MssI酶切位点，引物设计还要引入一个(Gly₄Ser)₄肽段，将scFv-PGT128连接到scFv-Hu5A8-IgG的5'端；然后以两种扩增产物为模板，以scFv-PGT128基因的正向引物和scFv-Hu5A8-IgG基因的反向引物为引物再进行PCR扩增，得到scFv-PGT128-linker-scFv-Hu5A8-IgG融合基因。

6.根据权利要求5所述的单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素的制备方法，其特征在于，步骤四中是通过BamHI和MssI双酶切连接法，把上述scFv-PGT128-linker-scFv-Hu5A8-IgG融合基因整合进图3A所示的优化后的pVAX载体中，其中融合基因的5'端以BamHI连接，3'端以MssI连接到载体，从而构建出如图3G所示的单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒，即pVAX-SG-Bispecific-IA。

7.根据权利要求6所述的单基因编码的双或多价特异性抗HIV免疫粘附素的制备方法，其特征在于，步骤五中细胞转染和蛋白纯化的步骤如下：提前一天将293T细胞以1.5×10⁵个细胞/毫升的密度铺在细胞培养皿中，转染当天用PEI转染试剂与单基因编码双特异性分泌型免疫粘附素的真核表达质粒pVAX-SG-Bispecific-IA充分混合，DNA与PEI转染试剂的质量比1:3，静置15分钟后将PEI-DNA混合物均匀加入293T细胞中，三天后将细胞上清用rProtein G试剂收集纯化分泌的免疫粘附素。