[发明专利]一种日本囊对虾放流效果的评估方法

说明书

技术领域

本发明属于海水动物增殖放流领域，特别涉及一种日本囊对虾放流效果的评估方法。

背景技术

日本囊对虾，又称日本对虾(Kuruma prawn)，学名Marsupenaeus japonicas,别名车虾、斑节虾、竹节虾，在分类学上隶属于甲壳纲、十足目、游泳亚目、对虾科、对虾属。原产日本、中国、菲律宾、澳大利亚等国，广泛分布于印度、西太平洋地区，主要在日本列岛、南非红海、阿拉伯湾、孟加拉湾日本及我国等海区，以日本的沿海数量最多。栖息地底质以沙质底为主，有潜沙习性，在自然海域，自仔虾期就潜沙，涨潮时出来觅食，退潮后就潜入浅水的沙中，当体长达2.5～3cm,逐渐改为晚上活动觅食，白天潜入沙中；分布区的底温范围为16～31℃，底层盐度范围在28～34之间；没有长距离洄游现象，仅在小范围内移动；不同生活时期的分布区域有所差异，幼虾主要分布在盐度较低、沙质底的河口水域，随着个体的成长，逐步移向深水区；产卵期较长，周年均有性成熟个体的出现，但主要产卵期为12～3月份；产卵盛期，雌性大于雄性，其它时期个体大小大致相等；雌虾体长和体重范围分别为50～200mm和4～95g，雄虾体长和体重范围分别为50～175mm和4～57g；不同的生长阶段日本囊对虾的饵料组成也不同，总体上以摄食底栖生物为主，兼食底层浮游动物和游泳动物。

日本囊对虾是我国海水虾类养殖的主要种类之一，特别是近年来在对虾养殖业深受病害侵害的情况下，日本囊对虾以其相对抗病力较强、适应性广、经济效益高、离水性较好以及适于长距离运输等优点倍受养殖业者的青睐。近年来，由于捕捞强度的不断加大、生态变迁、水域污染、病害频发以及人工养殖业对野生日本囊对虾的盲目需求等综合因素的影响，日本囊对虾野生资源数量急剧萎缩。为保护、恢复日本囊对虾种群和渔业资源，大规模种苗放流后日本囊对虾资源量得到了一定的恢复。不过由于无法准确区分回捕群体中放流个体和野生个体及数量，因而无法科学评估放流群体对野生资源的补充水平，分析野生资源的动态变化并制定科学的放流规划，这是日本囊对虾放流迫切需要解决的重大问题。

基于线粒体DNA的进化速率为核DNA的5-10倍，筛选到可代表种内变异的分子标记的概率较高；线粒体为母性遗传，重组率极低，还可应用于分析特定放流群体的后代，可避免由杂交原因引入的混淆。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种日本囊对虾放流效果的评估方法，该方法工艺简单，成本低，在此方法基础上制定科学的放流规划、有效促进野生日本囊对虾种群资源恢复，对于放流个体的子代也同样可以检测，还可用于多年连续监测。

本发明的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，包括：

(1)采集日本囊对虾放流区域的野生群体和准备用于放流的繁育群体，选用线粒体序列中的片段作为研究对象，通过PCR扩增和测序，分析野生群体和繁育群体的序列差异和单倍型分布，统计各单倍型的群体内频率；

(2)筛选出代表日本囊对虾种内差异的单倍型作为分子标记，确定该标记的序列特异性，计算分子标记在野生群体中所占的比例，定期监测比例变动范围(根据日本囊对虾的自然繁育周期)；

(3)选定在野生群体中历年所占比例变动小的分子标记，将带有选定的分子标记的母虾用于人工繁育放流用的子一代；

(4)在捕捞期回捕放流区域的个体，检测分子标记，计算带有选定的分子标记的个体在回捕群体中的比例，确定比例变动情况，从而估算放流群体对该区域所有日本囊对虾生态量的贡献值，最终确定该批次的放流效果。

所述步骤(1)中的线粒体序列为细胞色素B基因DNA序列、D-loop区序列或COI序列。

所述细胞色素B基因DNA序列如SEQ ID NO:1所示；对应的PCR扩增引物MJ-CYTB-F、MJ-CYTB-R序列如SEQ ID NO:2和NO:3所示。用DNA测序的方法确定检测样本的分子标记。测定的每个个体的CYTB基因序列的碱基与序列有少量差异，从而构成各种不同的单倍型。

所述步骤(1)中的PCR反应体系为：30μL反应体系，其中包括3μL10×PCR缓冲液，引物的浓度均为10μM，上游引物和下游引物分别为0.5μL，1μL2.5mM each dNTP，0.5μLTaq DNA聚合酶，0.5μL DNA模板；补充23.5μL去离子水至30μL。