[发明专利]一种高杀伤活性的免疫细胞群的培养方法

说明书

本发明公开了一种高杀伤活性的免疫细胞群的培养方法，在包含基础培养基、IL‑2、人CD137L、人SCF和任选的ConA的培养基中培养人外周血淋巴细胞，其中，IL‑2的浓度为10‑100ng/ml，人CD137L的浓度为10‑100ng/ml，人SCF的浓度为10‑100ng/ml，ConA的浓度为10‑100ng/ml。本发明的方法简单易于操作，培养时间长，可以获得具有高杀伤活性的免疫细胞群。

技术领域

本发明涉及细胞生物学及临床医学领域，尤其涉及肿瘤免疫细胞治疗方面，具体涉及人外周血淋巴细胞在体外进行高效培养的方法。

背景技术

肿瘤的发生、发展与宿主的免疫状态有着密切的关系，传统的肿瘤治疗手段包括手术、化疗与放疗，不但存在肿瘤迁移与复发的危险，而且具有严重的损伤正常组织和免疫功能的副作用。肿瘤细胞免疫治疗通过恢复和增强肿瘤患者的免疫监视能力和免疫杀伤功能，可以清除手术和放化疗后患者体内残存的肿瘤细胞，达到预防肿瘤复发、转移及根治肿瘤的目的，并且具有特异性强、毒副作用小等特点。肿瘤细胞免疫治疗主要是以免疫活性细胞为载体，通过体内或体外激活免疫细胞分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能或直接杀伤肿瘤细胞进而达到抗肿瘤的目的。

根据免疫细胞治疗的特点及抗肿瘤的机制，细胞免疫治疗可分为主动性免疫治疗和过继性细胞免疫治疗，或特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗。目前肿瘤细胞免疫治疗研究主要集中在过继性免疫治疗，利用体外扩增的免疫细胞，如淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)、肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL细胞)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)、树突状细胞(dendritic cells，DC细胞)、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)、基因修饰的T细胞等进行肿瘤的治疗。

近年来，国内外开展比较多的应用于临床上的外周血淋巴细胞体外培养的方法主要有这几类：

(1)经典的DC-CIK培养方法，结合市面上现有的商品化的淋巴细胞培养基，采用已经常规化的DC-CIK淋巴细胞培养方法，应用抗人CD3抗体、IL2、GM-CSF、INF-γ等主要刺激因子，分别刺激培养DC细胞和CIK细胞，在DC细胞经过肿瘤抗原激活后与CIK细胞共培养。

(2)自体TIL细胞(肿瘤浸润淋巴细胞)，TIL细胞是一群存在于肿瘤间质中的异质性淋巴细胞，在体内聚集到肿瘤部位的能力强于CIK和NK，仅杀伤其抗原特异性的肿瘤细胞，而对其他组织来源的肿瘤细胞无杀伤作用。主要操作是从新鲜的肿瘤组织中分离TIL细胞并用白细胞介素-2体外刺激，TIL细胞激活、扩增后成为细胞毒性T淋巴细胞，并经体外筛选和大量扩增，可以对表达特异性抗原的肿瘤细胞行使杀伤功能。

(3)自体NK细胞(自然杀伤细胞)培养，NK细胞用于肿瘤的细胞免疫治疗已有二十多年的历史，LAK细胞的主要抗瘤成分为NK细胞。主要采用建立NK细胞系和采用与构建的工程细胞共培养来定向刺激自体淋巴细胞中的NK细胞大量增殖。而关于用于共培养的工程细胞的研究已开展很多，也得到了多种细胞因子的组合表达方案。

但是，现有的培养方法仍存在较多的问题，主要表现在以下方面：培养方法比较复杂，步骤较繁琐。DC-CIK需要把DC细胞和CIK细胞分离开进行培养，需要专门制备肿瘤抗原去激活；TIL细胞培养需要配合临床手术，并且对得到的肿瘤组织需要进行TIL的分离和进一步的培养，操作比较繁琐；NK细胞建系成功后，操作简单，但风险较高，大部分建系细胞不能用于临床，而另外采用工程细胞共培养，存在工程细胞构建较难，即使构建成功，用于共培养的话，还需要对工程细胞进行特殊的灭火处理。因此，现有的淋巴细胞培养方法，普遍存在操作复杂，培养时间较短的问题。并且，国内这几年在临床上开展免疫细胞治疗的比较多，但普遍反映的是效果不佳或没有效果。因此针对这些问题，本领域尚需研发新型的淋巴细胞培养方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人外周血淋巴细胞体外培养方法，可以对人外周血淋巴细胞进行长时间(至少4周)的体外培养，得到可以高效杀伤肿瘤细胞的特定细胞群。