[发明专利]一种基于核酸适体来检测目标分子的酶联分析新策略

说明书

技术领域

本发明属于生物传感器领域，特别涉及一种用形成发夹结构的包含核酸适体序列的核酸序列识别目标分子，用互补核酸作为报告元素来定量和检测目标分子的酶联分析新策略。

背景技术

酶联免疫吸附分析(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，ELISA)是基于抗原和抗体的免疫反应和酶的高效催化反应而建立的一种生物分析技术，自1971年，被Perlmann和Weemen分别独立地创立以来，ELISA凭借其灵敏度高、特异性好、成本低、速度快、仪器设备简单等优势，得以迅速发展。己被广泛的应用于医学诊断、生物分析、食品安全和环境监测等领域中。但是由于抗体稳定性差，分析结果重现性低，以及存在交叉反应等缺点大大限制了ELISA作为标准分析方法的应用。

核酸适体(Aptamer)是单链DNA或者RNA，通过指数富集配体的系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)技术从核酸文库中筛选得到，能高效和特异的结合各种靶标。核酸适体有化学抗体之称，它的出现，为识别元素家族增添了新的活力。抗体的制备需在动物体内完成，耗时长而且制备数量有限，而核酸适体可以通过化学方法大量合成，并可以进行精确的化学修饰；抗体属于蛋白类，容易变性失活，而核酸适体性质稳定，能长期存放，变性后还可以复性；核酸适体通过折叠成特定的三维结构和目标物质结合，对于一些毒性较大、免疫原性较低的无法制得抗体的物质，却可以筛选得到核酸适体。对于抗体来说，不同制备批次间差异很大，导致检测平行性低，而筛选出来的核酸适体序列已经确定，通过PCR技术大量扩增再次合成时，准确性和重复性好，几乎不存在批次间的差异。另外核酸适体的价格比抗体便宜很多。这些显而易见的优点使得核酸适体成为更理想的分子探针，用核酸适体代替抗体发展ELISA有广阔的应用前景。

用核酸适体代替抗体发展ELISA的方法称为酶联核酸适体分析(Enzyme Linked aptamer Assay，ELAA)，己发展的ELAA的检测机制类似于ELISA，包括双抗夹心和竞争分析。双抗夹心法的夹心结构包括两种：aptamer/target/aptamer和aptamer/target/antibody，双抗夹心法简单实用，但是它检测的靶标必须满足一个条件，就是能同时结合两个识别元素。所以这种方法只适合检测蛋白等生物大分子，它们有足够大的尺寸，有足够多的结合位点，能同时结合两个识别元素，而小分子因为分子尺寸太小，只能结合一个识别元素，不能用夹心结构检测。竞争分析法适合小分子的检测，它的原理如下：标记了辣根过氧化物酶的靶标和待测靶标竞争与固相核酸适体结合。待测样品中靶标含量越高，则与固相核酸适体结合的越多，使得酶标靶标与固相核酸适体结合的机会就越少，这样加入底物后根据显色深浅判断，显色深者为阴性。竞争分析显色深者为阴性，浅者为阳性，一些操作上的细节都会导致每次的阴性对照数值存在差异，不利于结果判断。另外，检测中需要酶标记的目标分子，酶标小分子通常很麻烦，而且酶标之后也可能影响其结合核酸适体的能力，影响检测结果的准确度。以上两种酶联分析都存在某些缺陷，夹心性酶联分析不能检测小分子，竞争型分析适合检测小分子，但是该方法存在缺陷。所以发展能检测小分子的新型酶联策略是必要的。

食品安全及环境分析等领域的毒害物质多为小分子靶标，有迫切的检测需要。发展更简单合理的新型酶联适体检测策略检测小分子靶标，在食品安全和环境分析领域有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于核酸适体的酶联分析新策略，用于快速、灵敏的检测复杂试样中的小分子靶标，为现场快速检测提供技术平台。

本发明所提供的酶联核酸适体分析方法，用形成发夹结构的包含核酸适体序列的核苷酸序列识别目标分子，目标分子和核酸适体特异相互作用诱导发夹结构打开，通过互补杂交作用，打开的发夹的一段能捕获另一段带生物素(biotin)标签的DNA序列，通过生物素和链霉亲和素的特异相互作用，biotin可以结合HRP-Streptavidin(辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素)，HRP催化四甲基联苯胺(TMB)底物显色。检测原理如图1所示。

具体步骤如下：