[发明专利]口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中化学成分测定

说明书

技术领域

本发明属于中成药体内代谢研究技术领域，具体涉及及一种口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中两种成分的确定及其含量测定方法。

背景技术

热淋清颗粒是以苗药头花蓼为原料制成的单方制剂，收载于《中国药典》2010版。具清热解毒、利尿通淋的功效。用于湿热蕴结，小便黄赤，淋漓涩痛之症，尿路感染，肾盂肾炎见上述证候者。对泌尿系统感染具有确切的疗效。“热淋清颗粒”为国家中药保护品种、国家社保药物，并为唯一进入2010版《中国药典》的苗药，获国家发改委单独定价权。

根据文献报道，热淋清颗粒中主要的化学成分为酚酸类化合物和黄酮类化合物。现热淋清颗粒收载于《中国药典》2010版，该标准【含量测定】项以没食子酸为指标成分。为明确热淋清颗粒中中主要有效成分在体内的代谢过程，必须建立合理的尿液和粪便中热淋清颗粒主要有效成分的含量测定方法，以利于有效评价热淋清颗粒主要有效成分的排泄情况，为热淋清颗粒的更深入开发提供依据。

本发明以热淋清颗粒中的主要化学成分没食子酸和原儿茶酸为指标，建立了大鼠尿液和粪便中没食子酸和原儿茶酸的含量测定方法，并用该方法对大鼠口服热淋清颗粒后没食子酸和原儿茶酸在尿液和粪便中的排泄情况进行了研究。

通过文献发现，目前对于没食子酸在动物体内的排泄研究都是在对其代谢产物的定性研究，而关于其在尿液和粪便中含量测定方法研究未见文献报道。对于原儿茶酸的排泄研究，有文献(黄勇等，UPLC-ESI-MS/MS法研究注射用复方荭草在大鼠体内的排泄，中成药，2012)对其在尿液中的含量测定方法进行了研究，但对其在粪便中的含量测定方法文献中没有描述。本发明所建立的尿液中原儿茶酸含量测定方法与文献的区别在于以下两个方面：

(1)在尿液样品处理方法上，文献采用的是直接沉淀蛋白法，而本发明对直接沉淀蛋白和液液萃取两种方法进行了比较，发现液液萃取提取效果较好，峰形较好，无基质干扰(见表2)。

(2)在线性范围方面，文献中的线性范围是31～7470ng/mL，而本发明是10～1000ng/mL，可以看出本方法的定量限更低，相对文献而言，能更客观地反应原儿茶酸在大鼠尿液中的排泄情况。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中两种成分的确定及其含量测定方法。本发明通过对口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中两种成分没食子酸及原儿茶酸进行含量测定研究，为研究热淋清颗粒中没食子酸及原儿茶酸的排泄过程提供依据。

本发明是这样实现的：

提供一种大鼠口服热淋清颗粒后尿液和粪便中两种成分的测定方法，其包括以下步骤：

(1)尿液测试样品的制备：

(a)取热淋清颗粒0.5～4g，加5～10倍水溶解，通过灌胃给药方式给大鼠(体重230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg；

(b)分别在0～48h采集大鼠尿液，记录尿量，将尿液样品3000～5000r/min转速离心5～30min后，取上层液转移至新空白EP管中；

(c)加入内标岩白菜素母液10μL，然后用乙酸乙酯萃取，尿液与乙酸乙酯的体积比为1：4～1:8，萃取时间2～5min，涡旋混匀30～60s后，在0～10℃恒温下以10000～12000r/min离心5～15min；

(d)上层液转移至新空白EP管中，于30～50℃氮气流吹干，残留物用100μL流动相溶解，涡旋混匀30～60s后，在0～10℃恒温下以10000～12000r/min离心5～15min，取上清液即为尿液供试品溶液；

(e)按步骤(b)至步骤(d)的方法对未服用药物的空白尿液进行处理，得到尿液空白溶液；

(2)粪便测试样品的制备：

(a)取热淋清颗粒0.5～4g，加5～10倍水溶解，通过灌胃给药方式给予大鼠(体重230-270g)热淋清颗粒水溶液10ml/kg；

(b)分别收集48h内大鼠粪便，将大鼠粪便烘干，称重，取0.5g样品加入10倍量水制成混悬液，将样品3000～5000r/min转速离心5～30min后，取上层液转移至新空白EP管中；

(c)加入内标岩白菜素母液10μL，然后用乙酸乙酯萃取，尿液与乙酸乙酯的体积比为1：4～1:8，萃取时间2～5min，涡旋混匀30～60s后，在0～10℃恒温下以10000～12000r/min离心5～15min；