[发明专利]过量共表达磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶提高钝齿棒杆菌精氨酸产量

权利要求书

1.一种重组质粒pDXW-10-pfk-pyk，其特征是以Corynebacterium crenatum SYPA5-5基因组DNA为模板，扩增得到编码磷酸果糖激酶的基因(SEQ ID NO：1所示序列)和丙酮酸激酶的基因(SEQ ID NO：2所示序列)，将其串联到表达载体pDXW-10上，获得重组质粒pDXW-10-pfk-pyk。

2.权利要求1所述重组质粒的构建方法，其特征是串联表达磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，构建方法为根据C.crenatum SYPA5-5的全基因组序列，设计磷酸果糖激酶基因pfk的PCR上游引物5’-ACCGGAATTCGAAAGGACATGGAAGACATGCGAATTG-3’(EcoRI)和下游引物5'-ACCGCTCGAGCTATCCAAACATTGCCTGG-3’(XhoI)，丙酮酸激酶基因pyk的PCR上游引物5’-GGAAGATCTGAAAGGACATGAACGATGGGCGTGGATAGACGAAC-3’(BglII)和下游引物5’-CGCCTGCAGTTAGAGCTTTGCAATCCTTG-3’(PstI)，扩增得到pfk基因和pyk基因，与克隆载体pMD18-T连接构建克隆载体pMD18-T-pfk和pMD18-T-pyk，用EcoRI和XhoI双切pMD18-T-pfk和pDXW-10，胶回收pfk基因片段和线性化pDXW-10载体，连接后转化E.coli JM109，获得重组质粒pDXW-10-pfk，用BglII和PstI双切pMD18-T-pyk和pDXW-10，胶回收pyk基因片段和线性化pDXW-10载体，连接后转化E.coli JM109，获得重组质粒pDXW-10-pyk，再以pDXW-10-pyk为模板，5’-TCCCCGCGGTCCGGAGCTTATCGACT-3’(SacII)和5'-CGCCTGCAGTTAGAGCTTTGCAATCCTTG-3’(PstI)为引物进行PCR扩增，得到含tacM启动子的pyk基因片段，用SacII和PstI双酶切pyk基因片段和重组质粒pDXW-10-pfk，胶回收pyk基因片段和线性化的pDXW-10-pfk，连接后转化E.coli JM109感受态细胞，获得重组质粒pDXW-10-pfk-pyk。

3.一株串联加强表达磷酸果糖激酶和丙酮激酶的重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pDXW-10-pfk-pyk，其特征是将权利要求2中构建的重组质粒pDXW-10-pfk-pyk电击转化到C.crenatum SYPA5-5中，测定磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的酶活，重组菌中磷酸果糖激酶的比酶活为0.51U·mg^-1和丙酮酸激酶的比酶活为2.85U·mg^-1，分别比原始菌提高了3.2倍和4.0倍。

4.利用权利要求3所述的重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pDXW-10-pfk-pyk进行发酵培养合成精氨酸，其特征是经种子活化后。种子液以8％(v/v)接种量转接5L发酵罐发酵培养基(g·L^-1)：葡萄糖150，(NH₄)₂SO₄20，酵母粉10，KH₂PO₄1.5，MgSO₄·7H₂O0.5，FeSO₄·7H₂O0.02，MnSO₄·H₂O0.02，组氨酸5×10^-4，生物素8×10^-5，氨水控制pH7.0～7.2，装液量3L/5L；通气量3L·min^-1，转速600r·min^-1，30℃发酵96h，重组菌L-精氨酸产量为48.7g·L^-1，比出发菌株提高27.5％。