[发明专利]过量共表达磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶提高钝齿棒杆菌精氨酸产量

说明书

技术领域

过量共表达磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶提高钝齿棒杆菌精氨酸产量的方法属于基因工程和代谢工程领域。

背景技术

L-精氨酸(L-arginine)作为人和动物体内的半必需氨基酸，维持机体氮元素平衡，是尿素循环的中间代谢物，同时具有独特的生理和药理功能，在医药、食品、畜牧业等领域具有广泛的应用。微生物发酵法生产L-精氨酸对环境污染小，是比较经济和有效的方法。

L-精氨酸在微生物体内的合成途径是葡萄糖经EMP途径分解的丙酮酸以乙酰-CoA的形式进入TCA循环，TCA循环的中间代谢物α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化生成谷氨酸，谷氨酸经过多个酶的作用下生成L-精氨酸。

前期对精氨酸生产菌株的改造多集中在谷氨酸到精氨酸合成途径，分析研究该途径中相关酶的性质，发现乙酰谷氨酸激酶为关键酶，对其定点改造提高了精氨酸产量，并将精氨酸合成基因簇加强表达，提高了精氨酸产量。微生物体内L-精氨酸的合成涉及多个途径，因此考虑通过加强EMP途径提高精氨酸产量。

磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，EC2.7.1.11)又叫6-磷酸果糖激酶，催化果糖-6-磷酸进一步磷酸化生成果糖-1，6-二磷酸，其催化效率很低，EMP途径的速率严格地依赖该酶的活力水平。丙酮酸激酶(pyruvate kinase，EC2.7.1.40)催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸和ATP，丙酮酸作为共同代谢中间物可以进一步被氧化，或用作结构原件，可以说丙酮酸激酶控制着丙酮酸的外流量，进而调节EMP途径。

Andersen研究发现将Lactococcus lactis中磷酸果糖激酶突变失活后，突变株的磷酸果糖激酶活性降低2倍，生长速率降低57-70％，EMP途径代谢流则降低62-76％。Papagianni在L.lactis中克隆表达来自黑曲霉中磷酸果糖激酶的基因，发现重组乳酸菌糖酵解能力增强，葡萄糖消耗速率提高，且能耐受更高浓度的葡萄糖。Emmerling在大肠杆菌中克隆表达来自嗜热芽孢杆菌的丙酮酸激酶基因，发现重组菌的葡萄糖消耗速率增加10％，在此基础将重组大肠杆菌中的磷酸果糖激酶进行加强表达，发现葡糖糖消耗速率提高25％，推测大肠杆菌中EMP途径代谢流的增强可以通过加强表达丙酮酸激酶或者共同加强表达丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶来实现。

发明内容

本发明的目的是提供一株钝齿棒杆菌EMP途径关键酶基因表达的重组钝齿棒杆菌，该重组菌中的磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶串联加强表达，因而提高了重组钝齿棒杆菌中EMP途径代谢强度，来提高发酵法生产L-精氨酸的产量。

本发明所述的重组菌是在研究室保藏的高产精氨酸的钝齿棒杆菌中共同加强表达磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶得到的，该高产精氨酸钝齿棒杆菌是采用传统诱变育种手段获得的一株钝齿棒杆菌，该菌株已经于2011年07月第27卷第七期的《生物工程学报》杂志中公开。

本发明的技术方案：

1.获得重组质粒pDXW-10-pfk和pDXW-10-pyk

根据NCBI中Corynebacterium glutamicum ATCC13032的全基因组序列，设计磷酸果糖激酶基因pfk的PCR引物P1和P2，丙酮酸激酶基因pyk的PCR引物P3和P4：

P1：5’-ACCGGAATTCGAAAGGACATGGAAGACA TGCGAATTG-3’EcoR I

P2：5’-ACCGCTCGAGCTATCCAAAC ATTGCCTGG-3’Xho I

P3：5’-GGAAGATCTGAAAGGACATGAACGATGGGCGTGGATAGACGAAC-3’Bgl II

P4：5’-CGCCTGCAGTTAGAGCTTTGCAATCCTTG-3’Pst I