[发明专利]一种检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒

权利要求书

1.一种检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于包含有：包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、阳性对照和阴性对照、检测用抗原、浓缩洗涤液、酶结合物、酶显色底物和终止液；所述的检测用抗原为猪瘟病毒Erns蛋白。

2.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的检测用抗原的浓度为5-10μg/mL；所述的猪瘟病毒Erns蛋白通过包含如下步骤的方法制备得到：提取猪瘟病毒的RNA为模板通过反转录PCR扩增Erns蛋白目的基因，将目的基因与连接到pET30a载体上再转入含有PGrO7重组质粒表达伴侣蛋白GroEL的BL21进行原核表达、纯化得到纯化的重组猪瘟病毒Erns蛋白；其中扩增引物为：

CSFV-Erns基因上游引物：5’-CGGGATCCGAAAATATAACTCAGTGGAACCTGA-3’，

CSFV-Erns基因下游引物：5’-CGCTCGAGGGCATAGGCACCAAACCAG-3’。

3.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的包被抗猪IgM单克隆抗体的酶标板所包被的抗猪IgM单克隆抗体的量为0.1-0.5μg。

4.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的样品稀释液为含1% BSA、0.1%深海鱼明胶、0.02%叠氮化钠的PBS。

5.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照为用样品稀释液100倍稀释的含猪瘟病毒Erns IgM抗体的的猪阳性血清；所述的阴性对照为用样品稀释液100倍稀释的未感染过猪瘟病毒且未以猪瘟疫苗免疫过的健康猪阴性血清。

6.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的浓缩洗涤液为含0.5% Tween20的0.1mol/L、pH7.2-7.4的PBS，使用前用去离子水做10倍稀释。

7.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗猪瘟病毒Erns单克隆抗体，其浓度为10-20μg/mL。

8.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的酶显色底物为TMB显色液。

9.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的终止液为1mol/L的H₂SO₄溶液。

10.权利要求1-9任一项所述的检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将待测血清或其它样品用样品稀释液按1:100稀释，每孔100μL加入酶标板中，平行加样2～6个孔，同时设置阳性对照组、阴性对照组及空白对照组；其中阳性对照组加入100μL阳性对照液、阴性对照组加入100μL阴性对照液、空白对照组加入100μL样品稀释液，每组对照平行加样2～6个孔；

（2）加样完成后，轻振酶标板混匀孔中样品，37℃孵育1小时；

（3）弃去孔中溶液，洗涤液清洗3～5次，最后一次在吸水纸上拍干；

（4）每孔加入100μL检测用抗原，37℃孵育1小时；

（5）重复步骤（3），每孔加入酶结合物100μL，37℃孵育1小时；

（6）重复步骤（3），每孔加入酶显色底物100μL，室温避光反应10-15分钟；

（7）每孔加入100μL终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值；

（8）结果计算与判定：检测中阳性对照血清的OD值与阴性对照血清的OD值之差必须大于0.4时，检测被认为有效；CO值=阴性对照光吸收值OD_450nm×2.1倍，样品值=样品光吸收值OD_450nm/CO值，其中，样品值＞1为阳性；样品值≤1为阴性。