[发明专利]一种适用于苦苣苔科植物基因组大小的测定方法

说明书

技术领域：

本发明属于分子遗传与进化研究领域，具体涉及一种适用于苦苣苔科植物基因组大小的测定方法。

背景技术：

基因组大小(C-value)是指单倍体细胞核的DNA含量，基因组大小变异是物种形成和进化的重要原动力之一，越来越多的研究表明基因组大小在诸多关键的生物研究领域，如生态学、细胞学、分子生物学、系统学和进化生物学等方面，具有重要的理论及实际应用意义。理论预期，基因组的大小和物种的复杂程度成正比，即越简单的物种，其基因组越小；越复杂的物种，其基因组越大。越来越多的研究表明即使是属于同一门类的物种，它们的基因组大小的变化也可能非常大，而物种之间的复杂性却相差不大，即所谓的C值悖论。为了更好的理解物种的复杂性和其基因组大小之间的关系，对基因组大小的准确估计就显得越来越重要。

流式细胞术(Flow cytometry,FCM)是测定植物基因组大小快速而有效的方法。然而，植物体内大量次生代谢物质的存在(如花青素等)会极大的降低PI荧光染色强度，严重影响FCM方法测定基因组大小的准确性及有效性，进而导致基因组大小的后续分析及应用产生极大的偏差，在植物分类学、进化生物学、分子遗传学等方面的研究中出现错误的结果及结论。因此，在测定基因组大小之前，确定目的物种最适合的FCM测定方法，包括细胞核的提取、染色等技术条件至关重要。

苦苣苔科(Gesneriaceae)植物是我国喀斯特地区的特色类群，在全世界约有150属3700种，我国分布有58属470余种。该科在我国的分布和特有中心在我国南方喀斯特地区，由于喀斯特地区生境的高度异质性，苦苣苔科植物的功能性状具有强烈分化，表明该属植物是一个开展喀斯特地区植物对环境适应的理想模式系统，对于研究喀斯特生物多样性对环境变化的响应与适应具有重要意义。由于喀斯特土壤的低保水能力，周期性水资源缺乏，营养贫瘠等特点对该地区植物物种产生了较强的选择压力。之前的研究表明，土壤营养缺乏及非生物选择压力如干旱、强光、低温等，可以诱导叶片花青素等次生代谢物质的合成。因此，喀斯特生境的选择压力可能会影响FCM测定该区域植物基因组大小的准确性。尽管该植物类群在我国喀斯特生境适应进化及资源保护研究中具有重要地位，其最适合的基因组大小测定方法尚未明确。

可见，优化该类群基因组大小测定的FCM方法对于其后续生物学研究如系统分类学、进化遗传学具有重要的理论及实际意义。明确其最适合的测定方法，才能保证基因组大小测定的准确性，及后续研究如系统分类、与生态及适合度特征的相关性等分析的有效性，对我国喀斯特特殊生境地区特色植物类群的适应性进化机制的研究具有重要的推动作用。

发明内容：

为了解决苦苣苔科植物基因组大小准确测定的技术障碍及其后续植物分类学、进化生物学、分子遗传学等研究的实际应用，本发明的目的是提供一种适用于苦苣苔科植物基因组大小的测定方法。

本发明的适用于苦苣苔科植物基因组大小的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

材料准备：苦苣苔科的目的植物的新鲜嫩叶；

内参选择：仪器调试后进行样品荧光强度及基因组大小的预测(1C约为0.5-1.1pg)，根据预测基因组大小选择番茄(Solanum lycopersicum cv.‘Stupicképolni rané’,1C＝0.98pg)为主要内参，水稻(Oryza sativa ssp.japonica，1C＝0.43-0.45pg)为第二内参，并依据番茄基因组大小为标准对水稻基因组大小进行重新校对；

制备细胞核悬液：目的植物和内参物种，按照1ml核提取缓冲液LB01中加入20mg嫩叶的量，分别将目的植物和内参物种的嫩叶加入核提取缓冲液LB01中，然后将嫩叶切碎，用50μm孔径的过滤网过滤获得细胞核悬液，置于冰上备用，所述的核提取缓冲液LB01的配方为：15mM Tris、2mM Na₂EDTA、0.5mM spermine.4HCl、80mM KCl、20mM NaCl、15mMβ-mercaptoethanol、0.1％(v/v)Triton X-100，pH7.5；

再用RNA消化酶消化细胞核悬液中的RNA，RNA消化酶终浓度为50μg ml^-1；然后加入碘化丙啶荧光避光染色；最后应用流式细胞仪测定目的植物的基因组大小。

优选，所述碘化丙啶的终浓度为100μg ml^-1，染色时间为40min。