[发明专利]蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒

说明书

本申请是以下申请的分案申请：申请日：2012年8月27日；申请号：201210308753.X；发明名称：“蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒”。

技术领域

本发明属于食品安全领域的核酸检测。具体而言，本发明涉及蜡样芽孢杆菌快速检测的方法以及试剂盒。

背景技术

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)作为需氧芽孢杆菌群中的一种，无荚膜、能运动、革兰氏阳性杆菌，芽孢能耐受100℃达30分钟。该菌在自然界分布极广，常见于土壤、污水和尘埃中；在16-45℃能生长繁殖，最适生长温度为35℃。常因本菌污染富含碳水化合物的淀粉制品和富含蛋白质的乳制品等食品并在其中生长繁殖而引起食物中毒。蜡样芽孢杆菌也是人和动物的各种非肠道传染病的条件致病菌，可引起人类患结膜炎、呼吸系统、心血管系统、中枢神经系统、伤口感染等疾病。蜡样芽孢杆菌主要的致病物质是两种对人致病的耐热和不耐热肠毒素、大量的活菌及代谢产物如磷脂酶、核酸酶、溶血素等。近年来在蜡样芽孢杆菌作为皮肤上的创口感染菌的病例逐渐增多。现已发现也引起烧伤创面感染症状类似气性坏疽，发展很快，出现肌肉坏死。有全身中毒症状，是由该细菌的外毒素所致。这类细菌感染，对任何抗生素无效。

在食品企业，尤其是粮油加工企业，面临着严重的蜡样芽孢杆菌的污染治理问题，然而，摆在眼前的一个严峻问题是，蜡样芽孢杆菌的检测尤其是定量检测非常困难，使该生物危害因子的防治成为空谈。

建立一种行之有效的食源性蜡样芽孢杆菌的定量检测方法，以提高对该菌的检测速度和准确性，使受污染的食品得到及时处理，在公共卫生、食品卫生和口岸检疫等中都有重要意义。

然而，传统的检测方法耗时、操作繁琐，而基于免疫学原理的产品存在检测限高、特异性不强等问题。尤其是蜡样芽孢杆菌群的6种菌，包括蜡样芽孢杆菌(B.cereus)，炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)，假真菌样芽孢杆菌(B.pseudomycoides)以及韦氏芽孢杆菌(B.weihenstephanensis)，表型和生化特征相似度非常高，仅在产肠毒素种类、伴胞晶体的有无等方面存在差异，尤其是一些不产肠毒素或不携带伴胞晶体的变异菌株的存在，使该群的鉴别非常困难。

为此，本发明人经过长期研究，令人意外地研究出了一种以蜡样芽孢杆菌murB为靶标的锁核苷酸探针荧光定量快速检测的方法，不但能有效监控PCR扩增，而且蜡样芽孢杆菌的种特异性强，可有效区分蜡样芽孢杆菌群的其它芽孢杆菌，快速，检测灵敏度高，并可以应用于食品中蜡样芽孢杆菌的高通量筛检。

发明内容

本发明的第一个方面是提供一种新的蜡样芽孢杆菌的检测方法。该检测方法包括：1)提取待检测样品中的DNA；2)将步骤1)获得的DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR检测；其中，实时荧光定量PCR检测的靶标为蜡样芽孢杆菌murB基因。

本发明之所以将murB基因作为检测靶标是通过如下方法筛选得到的：

通过公用数据库检索下载搜集，建立关于蜡样芽孢杆菌和非蜡样的芽孢杆菌的基因库。选取一蜡样芽孢杆菌基因组作为目标基因组，利用程序genomecut.pl对其进行分割，片段大小为100bp。用BLAST对分割片段与种属内其他蜡样芽孢杆菌基因组进行相似性分析，利用程序cofinder.pl发掘种属内保守片段(即各蜡样芽孢杆菌基因组都含有的片段)。再用BLAST对保守片段与种属外其他非蜡样芽孢杆菌基因组进行相似性分析，利用程序spfinder.pl发掘种属特异片段(种属特异片段判断标准：种属内保守片段与其他所有已测序微生物基因组同源区域不超过25bp)，从而初步筛选到靶点序列。

运用基因组学的方法，先建立了基因组库，再在目的蜡样芽孢杆菌基因组中，通过在线BLAST一共筛选出了共100个特异性片段，即100个大小为100bp的特异性DNA序列片段。将这100个特异片段经过合并整理成87个，分别设计引物进行特异性和灵敏度的普通PCR检测评价，最后证明murB基因对应的引物特异性和灵敏度均为最佳，因此选定murB基因为检测靶标。