[发明专利]一株高产L-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建及应用

说明书

技术领域

本发明一株高产L-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建及应用，属于生物工程领域，具体涉及一种高产L-甲硫氨酸的方法。 

背景技术

L-甲硫氨酸，为含硫α硫氨基酸之一。其合成方法主要为化学合成法和发酵法两种。目前工业化生产应用的主要为化学合成混旋甲硫氨酸，而发酵法目前仍没有工业化应用实例。 L-甲硫氨酸广泛应用于饲料业，因饲料生产不需要高纯度的L-甲硫氨酸，目前仍以化学合成法为主。但因化学合成法会产生大量有害物质，发酵法生产甲硫氨酸越来越受到关注。但由于甲硫氨酸合成途径能耗较高，而且硫同化途径对细胞自身毒性较大，发酵法生产甲硫氨酸没有达到工业规模。 

目前发酵法合成甲硫氨酸主要利用大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌作为生产菌株，但因为大肠杆菌自身会产生内毒素，不利于食品安全发酵。同时大肠杆菌中甲硫氨酸代谢途径相较谷氨酸棒杆菌复杂，不利于菌株的代谢工程改造。而谷氨酸棒杆菌作为一株食品安全级生产菌株，其具有较高的谷氨酸及天冬氨酸家族氨基酸生产能力，也被用于生产L-甲硫氨酸，目前已广泛应用在赖氨酸，组氨酸，异亮氨酸等氨基酸的工业化生产中，但甲硫氨酸尚没有工业化应用的实例。 

发明内容

本发明的目的在于通过基因工程的方法，获得一株高产甲硫氨酸的重组菌株。 

根据本发明的一个优选实例，本发明提供的高产甲硫氨酸的重组菌株，包含基因组上高丝氨酸激酶编码基因thrB和TetR型阻遏蛋白mcbR编码基因的敲除。 

根据本发明的一个优选实例，本发明提供的高产甲硫氨酸的重组菌株，还包含外源性的表达反馈抗性天冬氨酸激酶片段，反馈抗性高丝氨酸脱氢酶片段和转运蛋白BrnFE片段。 

根据本发明的一个优选实例，外源表达的天冬氨酸激酶片段第311位Thr突变为Ile，外源表达的高丝氨酸脱氢酶片段第377位Gly突变为Glu。 

根据本发明的一个优选实例，提供的外源性片段存在于载体，所述载体为质粒pJYW-4。 

本发明的技术方案：一株高产L-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌，所述菌株分类命名为谷氨酸棒杆菌QW102/pJYW-4-hom^m-lysC^m-brnFE，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2014232。 

所述菌株QW102/pJYW-4-hom-lysC-brnFE，其同时存在以下遗传学特征：表达转运蛋白BrnFE，表达天冬氨酸激酶片段lysC和高丝氨酸脱氢酶片段hom，同时在基因组上缺失thrB和mcbR基因。 

用所述菌株CCTCC M 2014232生产L-甲硫氨酸的方法：以QW102/pJYW-4-hom^m-lysC^m-brnFE为生产菌，挑活化过的单菌落于50mL/500mL种子培养基，30℃、200 rpm培养18 h；然后按初始OD₅₆₂为1转接至1.2L/3L 发酵罐；通过流加氨水调节pH至7.0，通过关联搅拌转速和曝气率控制溶氧为30%，通过补加50%的葡萄糖控制残糖在20g/L以上；每4 h取样测定菌体浓度、残糖和氨基酸含量；检测结果显示，在发酵48 h 时甲硫氨酸产量达到最高，最高产量为3.1 g/L； 

种子培养基：25 g/L 葡萄糖，20 g/L 玉米浆，1 g/L KH₂PO₄，0.5 g/L MgSO₄，1.25 g/L 尿素；

发酵培养基：100 g/L 葡萄糖，20 g/L 玉米浆，20 g/L (NH₄)₂SO₄，1 g/L KH₂PO₄，0.5 g/L MgSO₄，0.01 g/L MnSO₄，0.01 g/L FeSO₄，1 mg/L VB1，6 mg/L VB6，0.1 mg/L VH，0.2 g/L VB12。