[发明专利]植物寄生线虫核糖体ITS区通用扩增引物新组合及其使用方法

权利要求书

1.一种植物寄生线虫核糖体ITS区通用扩增的引物组合，所述引物组合包括2对引物，其序列为： 

引物组合1： 

上游引物PXB101：5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′ 

下游引物AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′ 

引物组合2： 

上游引物F194：5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′ 

下游引物AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′。

2.根据权利要求1所述的引物组合的使用方法，其特征在于，包括如下步骤： 

步骤一、线虫DNA的提取： 

首先用双蒸水将线虫清洗干净，然后挑取单条线虫放入含8μL ddH₂O的PCR管中，再反复冻融2次后，加入2μL裂解液，最后56℃保温1h，95℃加热10min即可。经所述步骤提取获得的上清液可用于后续的分子实验；所述冻融为液氮处理1min，65℃水浴2min；所述裂解液为10×PCR Buffer、双蒸水与20mg/mL蛋白酶K的混合液，三者的体积比为10∶9∶1； 

步骤二、核糖体ITS区的PCR扩增： 

PCR扩增体系(25μL)：10×PCR Buffer(Mg²⁺)2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)1μL，上游引物(10μmol/L)0.5μL，下游引物(10μmol/L)0.5μL，rTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，模板DNA5μL，双蒸水15.3μL；PCR反应条件：94℃预变性3min；40个循环反应：94℃变性40sec，55℃退火40sec，72℃延伸1.5min；最后72℃保温5min，使反应物充分延伸； 

步骤三、PCR产物的电泳检测： 

每个样品取3μL扩增产物，使用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，设置电压160V，电泳30min后将凝胶放入EB染液中染色15min，随后置于凝胶成像系统中观察并拍照。 

3.根据权利要求2所述的使用方法，其特征在于：步骤二中PCR反应条件要求退火温度为55℃。 

4.根据权利要求2所述的使用方法，其特征在于：所述线虫为穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、玻利维亚短体线虫(Pratylenchus bolivianus)、斯氏短体线虫(Pratylenchus scribneri)、朱顶红短体线虫(Pratylenchus hippeastri)、松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(B.mucronatus)、豆伞滑刃线虫(Bursaphelenchus doui)、阿苏里伞滑刃线虫(Bursaphelenchus arthui)或水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)。