[发明专利]植物寄生线虫核糖体ITS区通用扩增引物新组合及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物线虫检疫鉴定领域，提供了2对植物寄生线虫核糖体ITS区通用扩增引物新组合及其使用方法，具体而言，所述方法通过使用新的ITS区PCR扩增通用引物组合，显著提高了所建立的PCR体系的扩增效率和成功率，能够扩增的植物寄生线虫种类也更加广谱，有效地解决了以前植物寄生线虫ITS区扩增中存在的诸多问题，适用于口岸及农林业相关检疫鉴定实验室应用。

背景技术

对植物线虫进行准确鉴定是研究线虫生物学习性及其发病规律的重要基础，对进一步制定有效的防治措施具有重要意义。传统的植物线虫鉴定方法主要依赖于形态特征和形态测量值，要求鉴定者要有极为丰富的经验和技巧。基于DNA的分子鉴定方法对鉴定者的要求相对较低，是形态鉴定的重要辅助手段，目前在线虫的分类鉴定中应用广泛。

在植物寄生线虫分子鉴定中，核糖体内部转录间隔区(ITS)是重要的分子标记之一。自上世纪90年代初以来，以核糖体ITS区核酸序列为分子标记对植物寄生线虫进行分类鉴定的研究有大量的文献报道(Vrain等，1992；Ferris等，1993；Hoyer等，1998；Waeyenberge等，2000；Subbotin等，2005；Burgermeister等，2009；De Luca等，2010)。分析发现，所有这些研究所使用的引物主要有3对，分别为pxb101和pxb481(Vrain等，1992)、F194和F195(Ferris等，1993)、Tw81和AB28(Subbotin等，2005)，而引物PRATTW81则是TW81略微修改获得(De Luca等，2010)。

虽然上述引物通过轮换使用在很大程度上能够解决大部分植物寄生线虫的ITS区扩增问题，但扩增效率和成功率不高是很多线虫学者面临的问题，尤其是对单条线虫进行扩增时更是如此。同时，研究发现有的引物对扩增的线虫种类具有一定的偏好性，比如TW81和AB28在扩增短体线虫时效果较好，但在扩增伞滑刃线虫和滑刃线虫时则完全失败，等等。

本研究在以前学者研究的基础上，对上述所报道的3对加1条引物进行重组，获得了12对引物组合，然后使用这12对引物分别对多种植物寄生线虫的ITS区进行扩增实验，以筛选出高效、稳定、广谱的植物寄生线虫ITS区通用扩增引物，为植物寄生线虫的检疫鉴定提供部分的技术支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中植物寄生线虫核糖体ITS区扩增存在的效率低、成功率低、广谱性低等缺陷，提供2对植物寄生线虫核糖体ITS区PCR扩增通用的引物组合及其使用方法，所述引物组合和使用方法的步骤如下：

所述2对引物组合序列为：

引物组合1：

上游引物PXB101：5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′

下游引物AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′

引物组合2：

上游引物F194：5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′

下游引物AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′

所述2对引物组合使用方法包括如下步骤：

步骤一、线虫DNA的提取：

首先用双蒸水将线虫清洗干净，然后挑取单条线虫放入含8μLddH₂O的PCR管中，再反复冻融2次后，加入2μL裂解液，最后56℃保温1h，95℃加热10min即可。经所述步骤提取获得的上清液可用于后续的分子实验；所述冻融为液氮处理1min，65℃水浴2min；所述裂解液为10×PCRBuffer、双蒸水与20mg/mL蛋白酶K的混合液，三者的体积比为10∶9∶1；

步骤二、核糖体ITS区的PCR扩增：

PCR扩增体系(25μL)：10×PCR Buffer(Mg²⁺)2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)1μL，上游引物(10μmol/L)0.5μL，下游引物(10μmol/L)0.5μL，rTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，模板DNA5μL，双蒸水15.3μL；PCR反应条件：94℃预变性3min；40个循环反应：94℃变性40sec，55℃退火40sec，72℃延伸1.5min；最后72℃保温5min，使反应物充分延伸；

步骤三、PCR产物的电泳检测：

每个样品取3μL扩增产物，使用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，设置电压160V，电泳30min后将凝胶放入EB染液中染色15min，随后置于凝胶成像系统中观察并拍照。