[发明专利]一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法

权利要求书

1.一种构建CDV反向遗传全基因载体的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)首先设计用于扩增CDV基因组不同片段的9对引物，引物的序列信息如下：

引物名称引物序列序列表顺序F1f5’-ACCAGACAAAGTTGGCTAT-3’SEQ ID NO:1F1r5’-AGTAAGCATCCTCATCTTGG-3’SEQ ID NO:2F2f5’-ATGAGGATGCTTACTAAGATGC-3’SEQ ID NO:3F2r5’-TGGATCTATTACTCTGACTTGG-3’SEQ ID NO:4F3f5’-AGAGTAATAGATCCAGGACTCG-3’SEQ ID NO:5F3r5’-AGGCACCACAGGACTAAC-3’SEQ ID NO:6F4f5’-CGAGCTCCGCTTCTAGGAATCTCACTT-3’SEQ ID NO:7F4r5’-ATCATATCACCTCCAGAGTATC-3’SEQ ID NO:8F5f5’-AGTCCTGTGGTGCCTCGGAAT-3’SEQ ID NO:9F5r5’-GGTAGCGGTCAGCATATTGATTATCT-3’SEQ ID NO:10F6f5’-ATGCTGACCGCTACCTCAGAC-3’SEQ ID NO:11F6r5’-GCCATAGCAGTATCAGTCATTAGCC-3’SEQ ID NO:12F7f5’-TAACATCGCCAACTCTACAACCA-3’SEQ ID NO:13F7R5’-CCAAGCTTCACTGTCTAGGCTAAGAGGCATAA-3’SEQ ID NO:14F8f5’-TGATACTGCTATGGCAATTG-3’SEQ ID NO:15F8r5’-TCATCCGTAATTCCTCAAGT-3’SEQ ID NO:16F9f5’-GAGGAATTACGGATGATTACCC-3’SEQ ID NO:17F9r5’-ACCAGACAAAGCTGGGTATGA-3’SEQ ID NO:18

以提取的病毒核酸反转录产物为模板，使用引物F1f和F1r扩增得到片段F1；引物F2f和F2r扩增得到片段F2；引物F3f和F3r扩增得到片段F3；引物F4f和F4r扩增得到片段F4；引物F5f和F5r扩增得到片段F5；引物F6f和F6r扩增得到片段F6；引物F7f和F7r扩增得到片段F7；引物F8f和F8r扩增得到片段F8；引物F9f和F9r扩增得到片段F9；所有产物连接T载体得到F1～F9质粒；

2)使用Ham Rz p1为上游引物和F1r为下游引物，以F1质粒为模板，扩增得到Ham Rz+F1片段，将Ham Rz+F1片段连接到T载体得到质粒Ham Rz+F1；使用上游引物F9f，HDV Rz p1和HDV Rz p2为下游引物，以F9质粒为模板，通过前后两轮PCR得到F9+HDV Rz片段，连接到T载体得到质粒F9+HDV Rz；

3)用引物Infusion_P1和F1r，以质粒Ham Rz+F1为模板；用引物F2f和F2r，质粒F2为模板；用引物F3f和Infusion_P2，质粒F3为模板进行扩增；三个产物依次连接入T载体为FA质粒；

引物Infusion_P3和F4r以质粒F4为模板的PCR产物；引物F5f和Infusion_P4以质粒F5为模板的PCR产物，二个产物接入T载体为FB(-)质粒，然后将质粒FB(-)和质粒F4经过Sac I和Hpa I双酶切后连接为质粒FB(+)；质粒FB(+)和质粒F7经过Nco I和Hind III双酶切连接成为片段质粒FB；

引物Infusion_P5和F8r以质粒F8为模板的PCR产物；引物F9f和Infusion_P6以质粒F9+HDV Rz为模板的PCR产物连接入T载体为FC质粒；

引物名称引物序列序列表顺序Infusion_P15’-GGATCCTCTAGAGATATCGCGGCCGCTTGTCTGGTCTG-3’SEQ ID NO:22Infusion_P25’-CTGCAGGTCGACGATATCAGGCACCACAGGACTAAC-3’SEQ ID NO:23Infusion_P35’-GGATCCTCTAGAGATATCAGTCCTGTGGTGCCTCGGAAT-3’SEQ ID NO:24Infusion_P45’-CTGCAGGTCGACGATATCGCCATAGCAGTATCAGTCATTAGCC-3’SEQ ID NO:25Infusion_P55’-GGATCCTCTAGAGATATCTGATACTGCTATGGCAATTG-3’SEQ ID NO:26Infusion_P65’-CTGCAGGTCGACGATATCGGGCCCCGCCCTCCCT-3’SEQ ID NO:27

4)将序列为SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的Oligo DNA溶解后退火形成双链，然后将pVAX1载体用NheI和ApaI双酶切后胶回收，与双链连接形成载体pVAX2；

5)然后将片段FA、FB和FC酶切，再依次连入载体pVAX2得到CDV全基因组感染性克隆pVAX-rCDV。