[发明专利]一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法

说明书

技术领域

本发明属于病源微生物基因组学研究技术领域，具体涉及一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法。

背景技术

犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)感染引起的，具有高度接触性、致死性的急性败血症。CDV在副粘病毒家族中与麻疹病毒、牛瘟病毒同属麻疹病毒属，是副粘病毒科中一个血清学上密切相关的属，宿主特异性却各自不相同。犬瘟热病毒感染犬可导致隐性感染，有肠道症状，或有呼吸道症状，有时伴有中枢神经系统症状。神经症状也可能是犬瘟热感染的晚期表现。

犬瘟热病毒基因组是不分节段RNA病毒全长15690bp，在自然界分离的病毒基因长度上存在高度一致性，并遵循六碱基原则。其3’-端和5’-端分别是先导序列和尾随序列，它们在调节基因复制和转录中起作用，5’-端的非编码区可能含有核衣壳化起始位点和编码反基因3’-端复制启动子。犬瘟热病毒自3’-端至5’-端非重叠方式表达6个结构蛋白分别为核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,NP)、磷蛋白(Phosphoprotein,PP)、基质蛋白(Matrix protein,MP)、融合蛋白(Fusion protein,FP)、血凝素蛋白(Haemagglutinin protein,HP)和大蛋白(RNA-dependent RNA-polymerase protein,LP)

反向遗传学技术已广泛应用于病毒学研究的各个领域，极大地推动了病毒学基础与应用研究的快速发展。病毒反向遗传操作系统借助真核质粒使载体上的病毒cNDA在细胞内产生有活性的DNA/RNA片段，通常DNA和一部分RNA具有感染性可以产生病毒，另外一些RNA病毒需要病毒蛋白结合产生病毒。

在早期的CDV拯救系统使用能够产生RNA聚合酶的拯救细胞或表达RNA聚合酶痘病毒感染，载体含有T7RNA聚合酶启动子来产生病毒RNA。随着技术发展和研究深入，犬瘟热病毒广泛采用的拯救系统主要使用真核表达载体，两端分别加丁型肝炎核酶(Hdv Rz)和锤头核酶(Ham Rz)的全基因，再构建表达N、P和L蛋白的辅助质粒，共转染细胞以后产生核糖核蛋白复合物(RNP)进入细胞复制周期，产生CDV。这一方法首先在狂犬病毒上应用，这是首个应用此方法的负链RNA病毒，随后广泛用于其它负链RNA病毒，如正粘病毒、副粘病毒等。但副粘病毒科基因长度较长，通常在15k左右，所以随后的CDV拯救都是分6-10段扩增病毒基因片段逐段连接。例如GASSEN(Establishment of a Rescue System for Canine Distemper Virus)在2000文章中方法为例，作者选择12个酶切位点分11个片段扩增CDV基因包含两段核酶序列连接如T载体，然后逐段酶切连接入pEMC或pBS SK II载体，该方法构建感染性克隆需要进行11次亚克隆以获得完整基因。，极易在构建的过程中发生错误，且耗时长导致效率低下。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法，本发明的方法可以快速的构建CDV感染性克隆，方便后期操作，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种构建CDV反向遗传全基因载体的方法，包括如下的步骤：

1)首先设计用于扩增CDV基因组不同片段的9对引物，引物的序列信息如下：