[发明专利]一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法

权利要求书

1.一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)黑曲霉β-甘露聚糖酶基因编码区的克隆及其在毕赤酵母中的表达

提取黑曲霉总RNA，将其反转录成cDNA；根据已知的丝状真菌β-甘露聚糖酶基因编码区序列，设计一对简并引物，设计的引物为：上游引物MAN-F：5’-ATGAAG(T/C)T(C/T)TCCA(G/A)C(T/G)CCCTC-3’，下游引物MAN-R：5’-TTA(G/A)GC(G/A)CTA(T/C)(G/C)AATA(T/G)CAGCAAG-3’；

PCR反应体系为50μL：ddH₂O19μL，10μM上下游引物各1μL，模板cDNA4μL，2×Taq PCR MasterMix25μL；PCR反应条件均为95℃预变性3min，然后进行95℃30s，52℃30s，72℃90s，共35个循环，最后再72℃延伸7min；切胶回收PCR产物并将其克隆至T载体上；对所获得的β-甘露聚糖酶进行信号肽分析，将β-甘露聚糖酶成熟肽编码序列克隆至毕赤酵母表达质粒pPIC9K上，构建成pPIC9K-MAN质粒并实现其在毕赤酵母中的表达，并筛选一株能高表达β-甘露聚糖酶的重组菌；

(2)伴侣蛋白PDI基因编码区的克隆及pPICZαA-PDI质粒的构建

将伴侣蛋白PDI基因编码区的序列插入到pPICZαA质粒中，构建成pPICZαA-PDI质粒；

(3)共表达分子伴侣蛋白PDI对β-甘露聚糖酶产量的影响

转化pPICZαA-PDI质粒到表达β-甘露聚糖酶的重组菌中，诱导表达β-甘露聚糖酶，并对其表达条件进行优化，同时鉴定表达产物并分析表达产物的酶学性质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(3)中，所述优化的表达条件是：诱导表达时间为7d，甲醇的体积浓度为1.5％。