[发明专利]一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法。

背景技术

植物细胞壁主要由半纤维素、纤维素、木质素等组成。β-甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，由β-1,4-D吡喃甘露聚糖连接而成的线状多糖，主要存在于植物细胞壁和豆科植物种子中。作为一种非淀粉多糖，β-甘露聚糖能产生抗营养作用。单胃动物不含有降解β-甘露聚糖的内源酶，不能消除β-甘露聚糖的抗营养作用，因而对动物的生产性能产生负面影响。

β-甘露聚糖酶(β-mannanase，EC3.2.1.78)是一种半纤维素酶，以内切方式降解β-1,4糖苷键。β-甘露聚糖酶主要来源于微生物，如细菌、放线菌和真菌等。丝状真菌黑曲霉是一种重要的工业微生物，已被FDA认定为属于GRAS(公认安全)的微生物，其能分泌多种胞外酶和有机酸。目前，微生物来源的β-甘露聚糖酶已被广泛应用于造纸工业、食品工业、饲料工业、纺织工业和石油工业等。但所有这些工业化应用能否成功的关键因素之一是β-甘露聚糖酶的高水平表达。

毕赤酵母表达系统具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白质的翻译后修饰等优点，近年来已被广泛用于工业化生产各种异源蛋白，且被认为是最有效的蛋白表达系统之一。大量研究表明，当外源蛋白大量表达时，酵母分泌途径的超载导致内质网工具酶量的减少，造成蛋白错误的装配折叠而使其聚集在内质网中，最终导致蛋白表达量降低。而在酵母中共表达能辅助蛋白质正确折叠装配的分子伴侣能改善这一状况。分子伴侣的概念早在1978年被Laskey等提出，它能帮助蛋白质正确折叠和提高外源蛋白表达量，从而逐渐被众多学者所关注。蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)是内质网中一种重要的折叠催化剂，能通过其氧化活性催化蛋白质分子中二硫键的形成，也能通过异构作用促进蛋白质正确折叠，同时还具有类似分子伴侣抑制错误折叠蛋白质聚集的功能。目前，国内外已有很多成功实例表明PDI能提高外源蛋白表达水平。Inan等(2005)研究发现过表达PDI可使钩虫分泌蛋白(Na-SP1)在毕赤酵母中的表达量显著增加；屈琳(2009)发现共表达PDI能提高IFNβ-HAS在毕赤酵母中的表达量达60％；Zhang等(2011)发现共表达PDI能增加β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的分泌表达；Sha等(2013)研究表明，共表达PDI能显著增加脂肪酶在毕赤酵母中的产量。

综上可知，酵母细胞表达外源蛋白分泌产率与PDI及二硫键形成有很大的相关性。国内外有很多研究证实了酵母中PDI的过量表达能大幅度提高外源蛋白的表达量。因此，当蛋白质含较多的二硫键时，了解和操纵内质网中二硫键形成途径是提高外源基因表达水平的关键。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法。

本发明的技术方案如下：

一种共表达伴侣蛋白提高β-甘露聚糖酶基因表达水平的方法，其步骤如下：

(1)黑曲霉β-甘露聚糖酶基因编码区的克隆及其在毕赤酵母中的表达

提取黑曲霉总RNA，将其反转录成cDNA；根据已知的丝状真菌β-甘露聚糖酶基因编码区序列，设计一对简并引物，设计的引物为：上游引物MAN-F：5’-ATGAAG(T/C)T(C/T)TCCA(G/A)C(T/G)CCCTC-3’，下游引物MAN-R：5’-TTA(G/A)GC(G/A)CTA(T/C)(G/C)AATA(T/G)CAGCAAG-3’；

PCR反应体系为50μL：ddH₂O19μL，10μM上下游引物各1μL，模板cDNA4μL，2×Taq PCR MasterMix25μL；PCR反应条件均为95℃预变性3min，然后进行95℃30s，52℃30s，72℃90s，共35个循环，最后再72℃延伸7min；切胶回收PCR产物并将其克隆至T载体上；对所获得的β-甘露聚糖酶进行信号肽分析，将β-甘露聚糖酶成熟肽编码序列克隆至毕赤酵母表达质粒pPIC9K上，构建成pPIC9K-MAN质粒并实现其在毕赤酵母中的表达，并筛选一株能高表达β-甘露聚糖酶的重组菌；

(2)伴侣蛋白PDI基因编码区的克隆及pPICZαA-PDI质粒的构建

将伴侣蛋白PDI基因编码区的序列插入到pPICZαA质粒中，构建成pPICZαA-PDI质粒；

(3)共表达分子伴侣蛋白PDI对β-甘露聚糖酶产量的影响