[发明专利]一种从种传和土传媒介中定量检测稻曲病菌的方法

权利要求书

1.一种从种传和土传媒介中定量检测稻曲病菌的方法，其特征是，其步骤如下：

(1)对被检样品进行预处理，快速提取被检样品的DNA；

(2)标准曲线的构建

PCR反应体系为：2.5μL10×PCR buffer，2μL2.5mM dNTPs，0.25μL5U/μL Taq聚合酶，10pM引物uvr1497F/UV-B3各1μL，1μL提取的水稻稻曲病基因组DNA，补灭菌蒸馏水至25μL；其中，uvr1497F的序列为5′-CCGCTGCCTAAGATAAAGTCC-3′，UV-B3的序列为5′-CAAGTGCGAGGATAACTGAAT-3′；

PCR反应的条件：94℃预变性3min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延长90s、进行35次循环；72℃延长7min；反应结束后，取5μL反应产物，在1％琼脂糖凝胶电泳上分离扩增产物，EB染色观察结果；将PCR扩增产物从凝胶上切取并用试剂盒回收，回收后产物连接到pMD-18-T载体，测序验证序列后，将该质粒命名为pMD18-T-UV，其浓度为10ng/μL；用该质粒DNA作为模板，10倍梯度系列稀释后用于构建检测稻曲菌的RealAmp标准曲线；RealAmp标准曲线是根据种子中pMD18-T-UV的质粒浓度与相应的Tt值之间的关系而构建的，X轴表示起始模板浓度的对数值，Y轴表示不同浓度模板扩增达到阈值所用的时间Tt；

(3)荧光核酸恒温扩增检测技术反应

RealAmp反应体系：总体积为25μL，1μL提取并纯化后的样品DNA作为模板，2.5μL10×Bst DNA polymerase buffer、1.0μL浓度为0.2μM的外侧引物UV-B3和UV-F3、0.5μL浓度为1.6μM的内侧引物UV-FIP和UV-BIP、1μL浓度为8U/μL的Bst DNA polymerase、1.0μL浓度为0.2μMSYTO-9荧光染料，补灭菌蒸馏水至25μL，然后再加入等体系的石蜡油覆盖整个反应液防止挥发；其中UV-F3的序列为5′-CTTGTGTTTTCCAATGCATGT-3′，UV-B3的序列为5′-CAAGTGCGAGGATAACTGAAT-3′，UV-FIP的序列为5′-ATGCCCGCCAGAATACTGGCGCAGAATTCAGTGAATCATCG-3′，UV-BIP的序列为5′-CCTCAAGCTCTGTCTTGCGACGAGACCGCCGATTCATTT-3′；RealAmp反应在ESE-QuantTubeScanner上进行，63℃反应90min，随后在80℃孵育10min以终止反应；反应结束后仪器自动根据标准曲线显示定量结果。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(3)中，10×BstDNA polymerasebuffer含有1.4mMdNTPs、0.8mM甜菜碱和8mM MgSO₄。