[发明专利]一种从种传和土传媒介中定量检测稻曲病菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及的是一种从种传和土传媒介中定量检测稻曲病菌的方法。

背景技术

稻曲病是由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens，有性态为Villosiclava virens)侵染造成的一种水稻穗部真菌病害；病原菌侵染导致水稻小花上形成体积数倍于稻粒的病原菌菌落，即稻曲球。近年来，随着优质杂交稻的推广和大面积种植，大量氮肥的应用，为稻曲病的发生流行创造了有利条件，由一个历史上零星、偶发性病害演变成为中国各水稻产区的主要病害之一。稻曲病的发生不但对水稻的产量造成很大影响，而且稻曲病菌能够产生大量毒素，对人、动物和植物的细胞分裂具有强烈的抑制作用。因此，稻曲病的发生不仅使水稻减产，而且还会污染粮食，影响到粮食安全，控制稻曲病任重道远。

稻曲病的症状只在水稻的生育后期显现，出现在水稻的穗部，在此之前水稻植株的叶片、茎秆等部位没有任何发病症状。在田间的自然条件下，一般在水稻开花后1周左右开始有幼嫩的稻曲球出现，开花3周后稻曲球体积达到最大并在其外围产生大量的厚垣孢子。在昼夜温差较大的天气条件下，水稻成熟晚期稻曲球的表面可形成一至数个形状不规则的菌核，菌核可在一定条件下萌发产生子囊孢子，可能成为下一次侵染的菌源。

目前对稻曲病的研究比较有限，很多基础理论问题研究很少，对于病原菌的侵染机制，病害循环等存在很多争议，而这些问题的解决对于如何开展快速分子检测以及有效病害综合防控十分重要。最近，对稻曲病的侵染位点以及侵染的机制有了重大突破。通过对稻曲球的连续切片表明，稻曲病的初侵染位点是水稻的花丝组织，并最易侵染位于子房和浆片之间的3个花丝。稻曲病菌从不侵染水稻子房和花药，但偶尔会有次生菌丝侵染柱头和浆片的外围组织。病原菌侵染模式属于细胞外侵染和扩展，病原菌菌丝不直接穿透和进入寄主细胞，只在细胞间穿行，并最终将花丝组织的细胞壁完全降解。在稻曲球发育过程中，稻曲病菌虽然产生毒素但并不直接杀死寄主细胞，因此稻曲病菌属活体营养型病原菌。此外，通过GFP标记的菌株，Hu et al.对稻曲病的初浸染位点的研究结果则进一步证实稻曲病是通过小穗内部的花丝进行初侵染的。菌丝在人工接种后24h开始浸染，在接种后168h后菌丝累计达到最高水平，在水稻抽穗前，菌丝沿着感染的花丝向上延伸到达花药的顶端后包裹所有的花器官并产生稻曲球。

虽然取得上述重大突破，但是对于稻曲病的病害循环，一直未取到一致性的研究结果。早在20世纪60年代，Ikegami等就对稻曲病菌的苗期侵染进行了组织学研究。结果发现，稻曲病菌可以成功侵染水稻萌发初期的幼嫩胚芽鞘，但并没有发现稻曲病菌能够像黑粉菌那样抵达植株茎尖部的穗原基。此外，后续稻曲病菌的苗期侵染进行细胞学观察发现稻曲病菌可侵染水稻幼嫩的胚根，而PCR检测结果表明整个植株包括穗和籽粒都可携带病原菌。

通过对稻曲球进行形态学观察以及采用GFP标记菌株研究稻曲病的侵染位点和侵染机制都已经证实稻曲病是特定时期(水稻抽穗期)、特定位点(小穗内部的花丝)侵染的。此外，研究表明厚垣孢子虽然可以存活在种子以及土壤中，但是厚垣孢子萌发后只能存活非常短的时间，可能没有足够的时间在水稻孕穗期充当初侵染源完成侵染，也说明稻曲病菌在苗期侵染后，在自然条件下很难或不能有效扩展到穗部并引发病害。目前对水稻种子带菌是否可导致水稻发病存在大量争议，发病穗率比较低，远远低于高发病年份高感品种田间自然发病率。

最近研究显示稻曲病孢子可以附生定植在生物和非生物表面。高湿无水的状态下，稻曲病孢子可以无症状的侵染并定植在禾本科，十字花科以及茄科的植物叶片。而在有水条件下，在植物叶片、保鲜膜或玻璃纸上，这些孢子几天后就可以萌发并且形成菌丝，部分孢子还可以直接产生次生孢子。此外，如果逆向缺水处理，这些孢子要么出芽形成新孢子，要么反向形成厚垣孢子。这些结果显示稻曲病菌具有附生特性，越冬后的菌核或厚垣孢子附生在水稻或者中间寄主上，比如稗草，白茅以及浮萍。在高湿或者雨天萌发成为孢子并且附生在不同植物或者非生物材料的表面，水稻孕穗期随着雨水和风等媒介侵染水稻小穗从而导致发病。这些发现说明种子带菌是也可能成为稻曲病的初侵染源。综上所述，土壤中散布的菌核以及种子携带的厚垣孢子都可能是稻曲病的初侵染原。因此，必须有一种快速稳定、灵敏的定量检测方法对土壤和种子携带的稻曲病菌进行检测，对稻曲病的发病进行预警，是水稻安全生产的重要保证之一。