[发明专利]改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定化酶的制备方法，具体涉及一种利用改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，属于酶固定化技术领域。

背景技术

木瓜蛋白酶作为生物催化剂的重要成员之一，在食品、日化、医药等领域有广泛的应用。尽管木瓜蛋白酶具有优良的催化性能，但直接使用游离酶作为生物催化时，不仅回收率低，操作稳定性差，且无法实现重复利用，这就造成了酶的浪费，增加了成本，也使应用受到了一定的限制。酶的固定化技术则能够较好的解决上述问题。固定化木瓜蛋白酶的核心在于合理选择和设计性能优良的固定化载体和简单有效的固定化方法。然而在利用各类载体对木瓜蛋白酶进行固定化的过程中，人们逐渐发现传统的酶固定化方法虽然有很多的优点，但都有各自的不足。如包埋法中载体对大分子底物和产物扩散的限制；交联法中酶的不可再生；物理吸附法和离子结合法中酶易于从载体上脱落等。而由共价结合法制备的固定化酶与载体结合稳定，不易脱落，可以长期使用，因此克服了上述固定化方法中的一些不足，但该法的主要不足就在于固定化时常采用较激烈的条件，以牢固的共价键形式将酶固定在载体上，因而使酶活损失较大。为此人们期望通过对共价结合法进行改进。

现有的酶固定化方法主要有如下几种：

1.曲伟光等人利用聚合接枝法，合成了一种具有亲水性的环氧聚合物柔性载体：PS-acyl-P(AM-CO-GMA)，并成功用于柔性共价固定化脂肪酶。结果表明，所得固定化酶的热稳定性、操作稳定性和对有机溶剂的耐受性均有提高。但该载体不仅合成步骤繁琐且稳定性较差。

2.魏荣卿等人采用壳聚糖为载体，选用双醛淀粉作为改性功能基，柔性固定化木瓜蛋白酶，结果表明，所得固定化酶活回收率明显提高了。但由于双醛淀粉具有氧化度不均一、水溶性较差的缺点，不仅反应速度慢，而且严重影响酶的固定化的效果，进而影响酶的固定化性质。

3.选用聚苯乙烯系大孔树脂作为酶固定化载体，通过接枝改性的方法来改善载体的亲水性，用来固定化酶，但这类材料在合成过程中使用了氯甲醚，改性原理属于加成反应，在改性过程中有氯化氢生成，因此原子利用率不高，对环境也不友好。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种利用柔性载体制备固定化木瓜蛋白酶的方法，采用本发明的方法能解决共价结合法固定化酶活力回收率偏低的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种改性聚丙烯腈树脂柔性固定化木瓜蛋白酶的方法，包括以下步骤：

1)、制备柔性载体，依次进行以下步骤：

①、聚丙烯腈树脂改性：

将聚丙烯腈树脂微球加入至反应溶剂中浸泡20～28h，从而使聚丙烯腈树脂微球充分溶胀；然后加入作为亲水性柔性基团的四乙烯五胺(TEPA)，作为催化剂的NaOH，所述聚丙烯腈树脂微球：四乙烯五胺(TEPA)：NaOH的重量比为1：11～12：0.1～0.2；在氮气保护下于70℃～90℃、以150～200r/min的转速搅拌反应9～11小时；过滤后，得改性后的聚丙烯腈树脂微球；

②、改性后的聚丙烯腈树脂微球用反应溶剂浸泡洗涤至洗涤液为无色，再依次用去离子水、乙醇、乙醚洗涤(数次)，然后用去离子水洗涤，接着依次进行碱洗、水洗、酸洗和水洗，40～60℃下干燥至恒重，得改性后的聚丙烯腈柔性载体(PAN-TEPA)；

2)、载体的活化：

取1g改性后的聚丙烯腈柔性载体(PAN-TEPA)，用8～12ml(较佳为10mL)的pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液浸泡20～28h，从而使改性后的聚丙烯腈柔性载体(PAN-TEPA)充分溶胀；然后过滤分离，得浸泡后PAN-TEPA；

在浸泡后PAN-TEPA中加入体积浓度为2％～6％的戊二醛8～12ml(较佳为10mL)，于20～30℃(较佳为25℃)交联反应7～9h时后，过滤，所得滤饼依次用去离子水、pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液洗涤后，于40～60℃下真空干燥至恒重，得到戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体；

3)、制备固定化木瓜蛋白酶：

将戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体浸泡在8～12ml(较佳为10mL)的pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液的锥形瓶中，然后加入木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶与戊二醛活化的聚丙烯腈柔性载体的质量比为：0.06～0.10:1，于25～35℃(固定化温度)恒温振荡2～4h后，过滤分离；