[发明专利]一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法

权利要求书

1.一对引物，由如下(1)和(2)所示的DNA分子组成：

(1)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(2)SEQ ID No.4所示的DNA分子。

2.一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物。

3.一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法，包括如下步骤：以梯度稀释的非转基因烟草的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子分别为上游引物和下游引物，进行实时荧光定量PCR扩增；将稀释度最小的非转基因烟草的基因组DNA模板的浓度记作1，计算得到其他稀释度的非转基因烟草的基因组DNA模板的浓度与稀释度最小的非转基因烟草的基因组DNA模板的浓度的比值，将1和计算得到的各个比值记作拷贝数浓度值；以拷贝数浓度值的lg值为纵坐标，对应的Ct值为横坐标，绘制内参基因标准曲线，得到内参基因标准曲线公式1，同时以待检测转基因烟草的基因组DNA为模板进行上述实验，得到Ct值X₁；将Ct值X₁带入内参基因标准曲线公式1，得到待检测转基因烟草中的内参基因的拷贝数浓度值的lg值,即Y₁；

以梯度稀释的含有外源基因的质粒为模板，以外源基因的上游引物和下游引物为引物，进行实时荧光定量PCR扩增；将稀释度最小的含有外源基因的质粒模板的浓度记作1，计算得到其他稀释度的含有外源基因的质粒模板的浓度与稀释度最小的含有外源基因的质粒模板的浓度的比值，将1和计算得到的各个比值记作拷贝数浓度值；以拷贝数浓度值的lg值为纵坐标，对应的Ct值为横坐标绘制外源基因标准曲线，得到外源基因标准曲线公式2，同时以待检测转基因烟草的基因组DNA为模板进行上述实验，得到Ct值X₂；将Ct值X₂带入外源基因标准曲线公式2，得到待检测转基因烟草中的外源基因的拷贝数浓度值的lg值,即Y₂；

Y₂/Y₁即为待检测转基因烟草中的外源基因的拷贝数，当Y₂/Y₁小数点后第一位大于5时，整数部分加1，小于或等于5时，整数部分不变，整数部分即为转基因烟草中的外源基因拷贝数；

所述模板的浓度单位相同；

所述内参基因为核糖核酸还原酶基因RNR2；

所述外源基因为转基因烟草中转入的基因。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述梯度稀释的非转基因烟草的基因组DNA的浓度分别为0.0406μg/μL、0.00812μg/μL、0.001624μg/μL、0.0003248μg/μL、0.00006496μg/μL。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应体系为：模板2μL、10μmol·L^-1的上游引物、下游引物各0.3μL、Premix Ex Taq^TMII10μL，加入ddH₂O补足体系至20μL；

Premix Ex Taq^TMII具体购自宝生物工程(大连)有限公司；

所述实时荧光定量PCR的反应体系为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。

6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于：所述非转基因烟草为非转基因烟草品种K346。

7.权利要求1所述的引物、权利要求2所述的试剂盒在检测转基因烟草中外源基因拷贝数中的应用。