[发明专利]一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法；特别涉及一种利用实时荧光定量PCR技术检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法，属于生物技术领域。

背景技术

近年来，植物转基因技术被广泛的应用于生产药用蛋白、改善作物品质、提高作物产量等领域的研究。目前植物转基因所采用的方法主要是根瘤农杆菌介导法，但是农杆菌所携带的含有目的基因的T-DNA区域是随机的插入受体植物基因组中的，因而得到的转基因植株往往含有一到多个拷贝的外源基因。转基因植物中外源基因的拷贝数是影响该基因的表达量的关键因素，多拷贝的外源基因会直接导致基因沉默或者不能稳定表达。烟草(Nicotiana tabacum)是一种双子叶的茄科的植物，目前广泛的作为基因工程研究的模式植物，而转基因烟草中外源基因的拷贝数是直接影响目的基因的表达水平和稳定遗传的关键因素，因此，鉴定出转基因烟草中外源基因的拷贝数是进行后续研究的基础。

目前，在植物的遗传转化后期的研究中，确定外源基因是否整合到转化植株基因组上，以及确定转化植株的拷贝数对于后期的研究是非常重要的，传统的方法主要是使用Southern杂交，该方法的准确性已经得到了普遍的认可，但是该方法费时费力、每个泳道需要10-30μg的DNA样品等缺点，而且如果外源基因在插入转化植物基因组时发生重组，造成限制性酶切位点的丢失，就不能用Southern杂交进行拷贝数的检测，该方法需要昂贵的试剂，花费的时间较多，需要的DNA材料也较多，而植物组培分化形成的抗性苗往往较弱不适于大量取样，也存在鉴定出的多拷贝插入点不准确等缺点。实时荧光定量PCR方法是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料或者特异性的荧光探针，实时监测反应体系中荧光量的变化，获得达到一定荧光量(阈值)所需的循环数Ct。通过已知浓度的标准品及其对应的Ct值制作标准曲线，就可以准确的对未知样品进行定量。相比于Southern杂交，该方法方便、快捷、需要的DNA量较少、且不需要使用放射性物质，由于该方法的特异性强，因而得到的实验结果更加准确真实。实时荧光定量PCR不仅可以对特定的T-DNA序列进行扩增，也可以对转基因品系中基因重组进行检测。由于植物的生长周期较长，实时荧光定量方法使用较少的材料就可以进行检测，因此在植物培养的早期就可以进行检测筛选，避免了大量组培的工作。因而，实时荧光定量PCR技术是一种可行的转基因植株拷贝数分析的方法。

在以往的研究中发现，实时荧光定量PCR检测和Southern杂交所得的拷贝数结果十分接近，但是有部分结果显示实时荧光定量PCR所得的拷贝数稍高于Southern杂交。Ingham等在检测转基因玉米中外源基因的拷贝数时发现，实时荧光定量PCR所得的拷贝数结果高于Southern杂交。这种情况可能是由于多重因素造成的，比如在Southern杂交中酶切消化不完全、基因重排、显影本底的高低等因素都可能造成这种错误的结果。因而，实时荧光定量PCR得到的拷贝数结果更加接近于客观事实。

开发一种能检测鉴定出转基因烟草中外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR方法对进行后续研究具有重要影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法，利用的是实时荧光定量PCR技术，利用本发明提供的方法可以简单、快速、准确的检测转基因烟草中外源基因拷贝数。

本发明提供一对引物，由如下(1)和(2)所示的DNA分子组成：

(1)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(2)SEQ ID No.4所示的DNA分子。

一种检测转基因烟草中外源基因拷贝数的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述的引物。