[发明专利]一种利用SNP提高白桦细胞中总三萜和齐墩果酸含量的方法

说明书

所属技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用SNP提高白桦细胞中总三萜和齐墩果酸含量的方法。

背景技术

白桦树皮中具有重要的三萜类物质，三萜类物质可通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡或者抑制血管生成等方式发挥抗肿瘤作用，此外三萜类物质还有抗炎、抗病毒的作用。随着三萜化合物生物活性的发现其在医药卫生方面的价值逐步显现，目前已有以齐墩果酸等为主要成分的药物投入临床使用。然而，树木生长周期长，若获得白桦三萜需对树木进行砍伐或扒皮，破坏资源，加之其结构复杂，人工方法合成效率低，成本高等因素而成为制约其不能进行临床大规模应用的主要原因。以细胞全能性为基础建立起来的植物细胞培养技术为植物药生产提供了一条新途径。由于利用植物细胞培养法生产植物天然活性物质具有不受气候、病虫害等自然条件的影响,而且不占用土地,不消耗自然资源,生产周期短和人为可控等优点，因而被认为是解决植物药生产与天然植物资源可持续发展之间矛盾的一种新型生物技术。大量研究表明NO是植物次生代谢产物合成信号转导网络中的关键分子，具有重要作用。但目前尚未见使用NO的供体物质SNP促进白桦花药的愈伤组织和悬浮培养细胞进行合成白桦三萜和齐墩果酸的报道。

发明内容：

为保护白桦自然资源，建立可持续开发利用的资源生产程序，利用来自白桦花药诱导的愈伤组织和悬浮培养细胞，进行总三萜和齐墩果酸的合成与生产，同时利用高效液相色谱法进行定量检测。为进行工业化法大规模生产总三萜和齐墩果酸类药物的提供了新方法。

技术方案是：在超净工作台上，切下雄穗，用70％酒精浸泡5min，再用5％的次氯酸钠溶液消毒20min，然后放于已灭菌的培养皿中，选择适宜大小的雄穗，在解剖镜下用解剖针剥开雄穗，取出花药，接种到预先经过高温高压灭菌的各种组合的培养基上(NT+1.0mg/L水解酪蛋白+3％蔗糖+0.5～4.0mg/L2，4-D,0.2～4.0mg/L KT)进行愈伤组织的诱导。每瓶接种大约30-35个花药。先用暗培养一周后进行光培养。培养约7周后，获得花药培养愈伤组织。愈伤组织经过继代培养后，迅速增殖。

选择细胞生长速度快，松散且总三萜物质含量高的愈伤组织，进行继代和悬浮培养。并在有利于白桦悬浮细胞生长和次生代谢产物积累的B5+0.1～0.3mg/L6-BA+0.5～1.0mg/L TDZ悬浮培养基中培养细胞系。获得高产白桦三萜和齐墩果酸悬浮细胞系，经过滤，烘干，粉碎，有机溶剂(95％乙醇)提取步骤，利用液相色谱方法对白桦酯醇和齐墩果酸检测和定量分析。

本专利具有以下特点：

1)生产环境不受地域、季节、水质、病虫害、气候等自然环境的影响。

2)生产周期短，生产过程不产生大量废渣废水，安全无污染，具有生态效益。

3)培养的白桦悬浮细胞具有生产白桦三萜和齐墩果酸等多种物质的能力，实现了白桦天然植物资源及其药用成分的开发利用。

4)利用高效液相色谱方法进行齐墩果酸进行检测，方法简单，提取溶剂清洁无毒，操作方便。

5)为解决抗艾滋病和抗肿瘤天然药物来源紧缺，加速临床大规模应用，提供一种新途径，具有很高的经济效益和社会效益。

具体实施方式

1)植物材料来源

白桦取自东北林业大学白桦强化种子园内的开花优树。选择雄穗，取出花药，消毒后接种到预先经过高温高压灭菌的各种组合的培养基上(NT+1.0mg/L水解酪蛋白+3％蔗糖+0.5～4.0mg/L2，4-D,0.2～4.0mg/L KT)进行愈伤组织的诱导。愈伤组织经过继代培养后，迅速增殖。挑选生长状态良好的愈伤组织将其多次继代后转移至液体培养基悬浮培养。经过6代以上的转接，建立稳定的悬浮培养细胞体系，悬浮培养继代周期为15d，接种量为5g细胞于100mL液体培养基中。

2)培养条件

以白桦花药悬浮细胞为实验材料，按50g/L接种量接种于100mL B5液体培养基中，培养条件为：120rpm，25℃，光照强度2000lx，光周期16h，湿度40％～50％，培养周期为10d。培养基成分为B5基本培养基，附加激素及浓度为0.2mg/L6-BA和0.6mg/L TDZ，蔗糖20g/L，酸水解酪蛋白1g/L，pH5.5～6.0，121℃高温高压灭菌20min。

3)诱导子添加