[发明专利]一种腺病毒滴度的检测方法

说明书

技术领域

发明涉及生物细胞领域，特别涉及一种腺病毒滴度的检测方法。

背景技术

腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。噬斑法是测定病毒滴度最经典的方法，噬斑法方法操作繁琐，并且要求操作者有一定的操作经验。一般而言，1个噬斑是由一个病毒粒子产生的，以噬斑形成单位(PFU)表示。以水痘病毒为例，培养瓶内生长状态良好的2BS或MRC-5细胞传代到6孔细胞培养板，37℃，5％CO2培养箱培养到细胞形成单层进行试验，弃去培养液，加入合适稀释的水痘病毒，100ul/孔；37℃，5％CO2培养箱吸附，每20min摇匀一次，吸附40min，补加病毒培养液，3ml/孔，37℃，5％CO2培养箱培养8～10天；弃去病毒培养液，加入考马斯亮蓝染液，1ml/孔，染色10min；弃去染液，计噬斑数，病毒滴度＝噬斑数×稀释倍数×10(PFU/ml)。该方法存在几个方面的缺陷：a、检测时间长，一般需要8～10天；b、准确性不高，病毒感染细胞培养到8～10天，相邻的噬斑可能联合到一起，降低了病毒滴度，也可能母斑病毒产生子斑，增加了病毒滴度，即导致试验重复性差；c、噬斑只有数目多少，没有特异性表征，因而不能反映噬斑是否由水痘病毒感染细胞引发的病毒所致。传统的终点稀释法是以50％组织培养感染剂量(TCID₅₀)表示，TCID₅₀是指能使半数单层细胞孔(管)出现病变的病毒稀释度。以水痘病毒为例，培养瓶内生长状态良好的2BS或MRC-5细胞传代到96孔细胞培养板，37℃，5％CO2培养箱培养细胞形成单层进行试验。取水痘病毒悬液，用病毒稀释液按10被系列稀释(10-1-10-4)；稀释的病毒悬液加入到形成单层的组织培养细胞中，每稀释度感染4-12孔细胞，50uL/孔，37℃，5％CO2培养箱培养8-10天；显微镜观察并记录每稀释度每孔细胞有无病变，记录的数据按Reed-Muench法或Karber法计算病毒TCID₅₀值。

比色指示剂法是通过检测细胞活性、间接判断各孔是否感染。比色指示剂法实质也是一种终点稀释法，在结果判定步骤中引入比色指示剂操作，通过颜色变化判断各孔细胞是否感染病毒。噻唑蓝(MTT)是常用试剂之一，使用MTT作为比色剂的病毒滴度测定的方法俗称MTT法。荧光定量PCR方法通过测定病毒核酸而定量病毒，不能区分病毒死活。

终点稀释法测定病毒滴度俗称TCID₅₀测定，是使用最广泛的一种病毒含量测定方法。如前所述，将传统的终点稀释法测定腺病毒滴度有一定不足，主要是低浓度腺病毒感染细胞引起的细胞病变不明显，且精确度较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的检测病毒滴度的方法，该方法精确，稳定性好。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种检验腺病毒滴度的方法，包括：

1.实验准备

(第一天)开启生物安全柜紫外灯照射台面30分钟并将实验所用溶液预温至室温。

2.制备细胞悬液

取足量293细胞培养物按常规传代方法将细胞收集，倒置显微镜下计数后，用完全培养液调整细胞浓度为2×10⁵个/mL。

3.接种细胞悬液

取适量96孔细胞培养板做好相应标记，各孔加入100μL细胞悬液，每孔细胞数为2×10⁴个，37℃，5％CO2培养箱条件下培养过夜。

(第二天)

4.制备供试品溶液

取待测供试品用不含血清的DMEM培养液进行梯度稀释，稀释范围可根据VP调整，稀释倍数最大不超过10倍。可参照表1操作，接种的样品之间稀释倍数以2倍为宜。

表1TCID₅₀操作表