[发明专利]一种特殊糖肽富集和鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生化分析领域，具体的说，是一种通过化学标记，实现一类特殊糖肽的富集和鉴定。

背景技术

蛋白的糖基化修饰是生物体内最常见、最重要的一种翻译后修饰，与细胞粘附、蛋白折叠、信号传导和免疫应答等众多生物学过程密切相关。近些年来，在大规模的糖蛋白质组学的研究中，高效的糖蛋白/糖肽富集技术结合多维色谱分离技术以及高分辨的质谱的应用，极大的增强了糖组学的动态范围和检测限，越来越多的糖基化位点和糖蛋白能够被检测。然而，原始糖肽(包含糖链)的大规模鉴定仍然是一个挑战。因此，目前基于质谱的糖蛋白组学研究通常要先对糖蛋白/糖肽进行去糖基化的处理。

由于酶促去糖基化的高特异性和高选择性。近些年来，人们发现并发展了一批具有较强特异性的去糖基化酶，如PNGaseA、PNGaseF、EndoF和EndoH等(R.A.O'Neill,JournalofChromatographyA,1996,720,201)。其中PNGaseF由于其较强的去糖基化活性和普适性，在糖蛋白组学中得以广泛使用(D.F.Zielinska,F.Gnad,J.R.andM.Mann,Cell,2010,141,897)。早期的一些文献曾报道PNGaseF对于糖基化的天冬氨酸位于肽段N-或C-末端的糖肽具有较差的去糖基化活性(J.-Q.FanandY.C.Lee,JournalofBiologicalChemistry,1997,272,27058；T.PlummerandA.Tarentino,JournalofBiologicalChemistry,1981,256,10243)。然而，PNGaseF的这种歧视效应在当前的研究中却被广泛忽视。

基于该现象，我们提出了一种对这种特殊的糖肽的N端进行选择性标记的方法。通过标记，使PNGaseF能够识别被选择性标记的这种特殊糖肽，从而释放其糖链。在后续的质谱分析中，添加相关标记的可变修饰，即可获得鉴定。

发明内容

本发明为了克服PNGaseF对这种特殊糖肽的歧视效应，通过对这种特殊糖肽进行N端选择性标记形成酰胺键，从而使这种糖肽能够被PNGaseF识别，从而顺利的释放糖链，通过质谱分析并得到鉴定。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

首先利用蛋白酶对蛋白进行酶解得到肽段混合物，然后通过糖肽富集技术对肽段混合物进行富集得到糖肽，并对糖肽进行充分的酶促去糖基化。随后再次利用糖肽富集技术获得上述样品中未被去糖基化的糖肽，并对其氨基端进行化学标记，形成新的酰胺键，并重新进行酶促去糖基化，从而在质谱上获得鉴定。

所述的酶解、富集、标记和去糖基化详细说明如下：

(1)酶解：将蛋白进行变性还原烷基化后，利用蛋白酶，如胰蛋白酶(trypsin)、丝氨酸蛋白酶(lys-c)和蛋白内切酶(glu-c)，37℃条件下对蛋白进行酶解1-24h；

(2)富集：糖肽富集技术包含亲水作用色谱法、酰肼化学法或凝集素富集法等能从肽段混合物中富集得到糖肽的技术；

(3)标记：用一种标记试剂对特殊糖肽的N端进行标记，其中标记试剂为：可与N端α氨基形成酰胺键的酸酐类(如乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐)、羧基活化类(如N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶)、氨基酸类(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)中的一种试剂；

(4)去糖基化条件：在合适的条件下(pH7.5-8.5)，加入一定量糖苷酶(如PNGaseF)，37℃下孵育1-12h。

与传统糖肽富集相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明操作简单，只需要额外进行一步标记和去糖基化即可获得对特殊糖肽的鉴定；

(2)本发明可以克服糖苷酶(如PNGaseF)对于糖链位于肽段氨基末端这类糖肽的歧视效应，顺利切除其糖链；

(3)本发明鉴定到的特殊糖肽对于传统方法是一个较大的补充。

附图说明

图1为本发明的原理图；

图2为利用传统方法对核糖核酸酶B的糖肽进行去糖基化的产物；

图3为利用特殊方法对核糖核酸酶B的糖肽进行标记后再去糖基化的产物；

图4为策略A和B鉴定到的各类糖肽占总糖肽的比例；

具体实施方式

以下提供本发明一种富集和鉴定特殊糖肽的具体实施方式。

实施例1

标准糖蛋白核糖核酸酶B(RNaseB)中特殊糖肽(糖基化的天冬氨酸位于糖肽的N末端)的富集和鉴定。