[发明专利]一种评估NKT细胞对肝实质细胞杀伤能力的方法

权利要求书

1.一种评估NKT细胞对肝实质细胞杀伤能力的方法，其特征在于，是通过流式细胞仪检测肝实质细胞的死亡率来评估肝脏NKT细胞对肝实质细胞的杀伤能力，具体包括：

(1)取小鼠肝实质细胞株TLR2进行复苏处理，传一代后备用；

(2)取C57/B6品系野生型健康小鼠的肝脏和脾脏，各自研磨过滤后去除杂质，并分别制成肝淋巴细胞悬液和脾淋巴细胞悬液；

(3)通过流式细胞分选技术从肝淋巴细胞悬液中分选出肝脏的NKT细胞，制成NKT细胞悬液，并加入10ul的IL-2活化培养；

(4)通过流式细胞分选技术从脾淋巴细胞悬液分选出脾脏的树突细胞，制成树突细胞悬液；加入2ul的α-GalCer刺激活化，然后置于射线之下照射使树突细胞失活变性后，制成细胞悬液；

(5)将步骤(1)中小鼠肝实质细胞株TLR2加入培养板，并染CFSE-FITC染料；将步骤(3)中经处理的NKT细胞悬液与步骤(4)中细胞悬液混合后加入步骤(1)中的培养板；培养4小时后收集细胞，于细胞混合液中加入PI染色，上机检测；如果存在CFSE⁺细胞中PI阳性比例大于5％的情况，则说明NKT细胞对肝实质细胞杀伤能力处于过度杀伤水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体是指：

对小鼠的肝脏、脾脏组织分别进行下述处理：

取小鼠肝脏、脾脏各一只，剪碎后用研磨棒于滤网上研磨过滤至离心管，生理盐水洗去细胞碎片和内皮组织；除去离心管中多余上清，留下底部研磨物；

向装有肝脏组织研磨物的离心管加入20ml的33％质量百分比的Percoll细胞分离液，2000转离心18分钟后除去上层漂浮物和多余上清；加入1ml小鼠红细胞裂解液，裂解一分钟后，加入生理盐水至10ml终止反应，PBS洗一遍得到肝淋巴细胞悬液；

向装有脾脏组织研磨物的离心管直接加入1ml小鼠红细胞裂解液，裂解一分钟后，加入生理盐水至10ml终止反应，PBS洗一遍得到脾淋巴细胞悬液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中NKT细胞悬液的制备过程具体包括：

以1200转离心处理肝淋巴细胞悬液5分钟后弃去上清液，分别加入一毫升PBS经滤网过滤除去多余杂质；向悬液中加入anti-NK1.1-FITC抗体和anti-TCR-β-APC抗体各1ul，孵育30分钟后上机分选，得到肝脏的NKT细胞悬液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中树突状细胞悬液的制备过程具体包括：

以1200转离心处理脾淋巴细胞悬液分选5分钟后弃去上清液，分别加入一毫升PBS经滤网过滤除去多余杂质；向悬液中加入anti-CD11c-PE抗体1ul，孵育30分钟后上机分选，得到脾脏的树突状细胞悬液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述射线为100Gy的γ射线。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中检测过程具体是：

向装有2×10⁵/ml TLR2细胞株的培养板中，加入10uM的CFSE-FITC的染色液至盖住细胞表层，染色15分钟；弃去上清液，用PBS洗三遍；并按TLR2细胞株∶NKT细胞＝1∶10的比例加入步骤(3)所述NKT细胞悬液；再加入步骤(4)所述树突状细胞悬液，使树突状细胞与NKT细胞的数目等量；于37℃细胞培养箱孵育4个小时后，染上PI染料，取出上机检测。