[发明专利]一种评估NKT细胞对肝实质细胞杀伤能力的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测技术，具体为通过检测肝实质细胞的凋亡率来评估肝脏NKT细胞对肝实质细胞的杀伤能力。

背景技术

肝脏是动物最大的解毒器官，主要功能是合成、纤维蛋白原、凝血酶原等蛋白；参与生物转化和代谢，如胆汁合成、代谢和有机异物的转化；参与蛋白的加工和胆汁排泌。肝实质细胞为多面多角形，是肝脏的主要组成部分，在不同的生理条件下形态会发生变化。肝实质细胞里面含有许多复杂的细微结构：肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等，各自行使其功能。肝脏对维持人体健康非常重要，一旦肝细胞发生变性坏死，对生命的危害是非常大的。肝脏疾病是一类病情严重、临床症状复杂、病死率高、严重危害全球人类健康的疾病。肝病包括病毒性肝炎、肝硬化、原发性肝癌、自身免疫性肝病、酒精性肝病、药物性肝病、胆汁淤积性肝病等肝脏疾病。我国是肝炎大国，我国现有病毒性肝炎及脂肪性、酒精性、药物性、免疫性肝病等患者逾1亿。长期以来，由于肝病发病机制不明、缺乏有效防治有段，10％-20％可进展为肝衰竭、肝硬化、肝癌等重症肝病，病情凶险、病死率高，严重危害人民健康和社会发展。因为肝病发病机制及影响因素不甚明了，目前临床上缺乏特异、有效的治疗靶点和干预手段，不能完全逆转肝病的进程。肝损伤的发生是肝病的共同特征。目前已知的肝实质细胞发生坏死的主要原因是，病毒性肝炎、酗酒、自身免疫失调。这些因素常导致效应细胞对肝实质细胞进行攻击和杀伤，长此以往，后果不堪设想。

NKT(自然杀伤T)细胞发现于1986年，与其他T细胞抗原受体的(TCR)基因不同，NKT细胞有其独特的结构特征：1.同时表达T细胞受体和NK细胞受体。一般为CD4⁺和DN NKT(CD4-CD8-)细胞。其中NK1.1是NKT细胞最主要的表面标记；2.与其它T细胞亚群相比，NKT细胞具有独特的限制性TCR表达库；3.接受CD1d递呈的脂类抗原，在中发挥作用。NKT细胞在胸腺形成前的胎生初期6日在胸腺外组织分化，且机能处于不发达状态。NKT细胞不但能分泌Th1和Th2细胞因子，同时还具有与CD8⁺杀伤性T细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)相同的杀伤靶细胞作用。NKT细胞与疾病可能有诸多关系，例如的发病机制、变态反应的调节、抗作用及抑制感染等。NKT细胞受到刺激后，可以分泌大量的细胞因子和趋化因子，发挥免疫调节作用，是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。NKT细胞活化后具有NK细胞样细胞毒活性，可溶解NK细胞敏感的靶细胞，主要效应分子为Fas配体以及IFN-γ。最近已有研究显示，NKT细胞在肝炎、脂肪肝等肝病的发病过程中发挥重要作用，能够检测NKT细胞对肝实质细胞的杀伤能力，对于科学研究和临床治疗肝脏相关疾病提供重要帮助。

现有的测定效应细胞对靶细胞杀伤能力的方法主要有：形态法，酶释放法，核素法，化学发光法。但这些方法多用于CD8⁺T细胞或NK细胞对靶细胞的杀伤，尚未提出一种针对NKT细胞杀伤能力的方法，且在这些方法各自有其不完善之处。形态法人为因素较大，准确率低；酶释放以及化学发光法法稳定性较差；核素法虽然检测准确率较高，但对操作的安全隐患较大。因此，需找一种替代的办法是十分必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种通过检测肝实质细胞死亡率评估NKT细胞对肝实质细胞杀伤能力的方法。

为解决技术问题，本发明提供以下技术方案：

提供一种评估NKT细胞对肝实质细胞杀伤能力的方法，是通过检测肝实质细胞的凋亡率来评估肝脏NKT细胞对肝实质细胞的杀伤能力，具体包括：

(1)取小鼠肝实质细胞株TLR2进行复苏处理，传一代后备用；

(2)取C57/B6品系野生型健康小鼠的肝脏和脾脏，各自研磨过滤后分离出杂质，并分别制成肝淋巴细胞悬液和脾淋巴细胞悬液；

(3)通过流式细胞分选技术从肝淋巴细胞悬液中分选出肝脏的NKT细胞，制成NKT细胞悬液；加入10ul的IL-2活化培养；

(4)通过流式细胞分选技术从脾淋巴细胞悬液分选出脾脏的树突细胞，制成树突细胞悬液；加入2ul的a-GalCer刺激活化，然后置于射线之下照射使树突细胞失活变性后，制成细胞悬液；