[发明专利]一种提高人间充质干细胞分化能力的方法

权利要求书

1.一种提高人间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于提高人间充质干细胞分化能力的方法，按以下步骤进行：

一、优化hNanog基因序列合成：在不改变hNanog基因编码氨基酸序列的前提下，对hNanog基因的密码子进行优化，得到优化的hNanog基因；

二、载体连接：利用EcoRI和NdeI对优化的hNanog基因进行双酶切，获得目的基因片段，再利用EcoRI和NdeI对pET28b质粒进行双酶切，获得载体片段，将目的基因片段和载体片段于16℃连接24h，获得pET28b-nanog重组表达载体；

三、感受态大肠杆菌低温诱导优化的hNanog重组蛋白质表达：将pET28b-nanog重组表达载体转化进入大肠杆菌感受态细胞，经37℃恒温箱培养12小时后，回收全部菌落至含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，再向LB培养基中添加0.4mol/L的IPTG，在25℃、180rpm摇床培养12-18小时，之后于3500rpm离心10min，弃上清，收集菌体；

四、提取与纯化重组蛋白质：加30mL6mol/L盐酸胍至菌体中，200W超声破碎菌体，每次15s，重复6次，然后于12000rpm、4℃条件下离心30mins，取上清液，利用AKTA purify层析系统纯化，获得hNanog重组蛋白；

五、重组蛋白质诱导BMSCs成骨实验：将BMSCs接种到24孔板，每孔中5×10³个细胞，在每孔中添加500μL维持培养基，于37℃，5％CO₂条件下培养至贴壁生长后，去除维持培养基，每孔加入500μL成骨分化培养基和100nmol/L地塞米松，然后在每孔中加入25μLhNanog重组蛋白质，使hNanog重组蛋白质终浓度为50～500nmol/L，培养2～3周；

步骤一所述优化的hNanog基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的一种提高人间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于步骤二中hNanog基因双酶切的体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴，4h。

3.根据权利要求1所述的一种提高人间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于步骤二中pET28b质粒双酶切的体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴，4h。

4.根据权利要求1所述的一种提高人间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于步骤二中的连接体系如下：

。

5.根据权利要求1所述的一种提高人间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于步骤五所述维持培养基为含有体积浓度10％的胎牛血清、100U/mL青霉素G和100μg/mL硫酸链霉素的α-MEM培养基。

6.根据权利要求1所述的一种提高人间充质干细胞分化能力的方法，其特征在于步骤五所述成骨分化培养基为含有10mmol/Lβ甘油磷酸酯和0.5μg/mL维生素C的维持培养基。