[发明专利]一种提高人间充质干细胞分化能力的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高间充质干细胞分化能力的方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一种成体干细胞，能够自我更新，具有较强多向分化潜能，在适当的诱导条件下可以定向分化为软骨、成骨、肌肉、脂肪、神经等多种组织的细胞。MSCs广泛存在于脊髓、脂肪、脐带血等组织，来源充足，成为细胞及组织再生修复的理想候选种子细胞，被广泛地应用于骨、软骨、神经系统、心血管疾病的临床研究与治疗。临床移植需要相当数量的MSCs，人体内无论任何一种组织的MSCs数量都是有限的，大量采取MSCs会严重影响人体健康，因此，必须经过体外培养扩增达到移植需要的细胞数量。研究发现与其他成体干细胞相似，MSCs的增殖能力有限，随着培养代数及供体年龄的增加而逐渐衰老，MSCs的增殖能力呈减弱甚至丧失的趋势。仅靠传统的细胞培养方法无法获取可供临床移植需要数量的细胞，以致一些患者不得不放弃治疗，严重的阻碍了MSCs的临床再生医疗的开展。如何有效地抑制MSCs的衰老，建立高效率的MSCs体外扩增技术是干细胞研究领域的重点课题。

外源转录因子的导入主要采用包括病毒载体在内的各种载体将转录因子基因直接导入细胞的方式。但是，利用载体导入外源基因会影响基因组的稳定性，并且，外源基因的整合部位也可能干扰与癌症有关基因的正常表达，引起癌变的危险。

发明内容

本发明提供一种提高人间充质干细胞分化能力的方法。

本发明提高人间充质干细胞分化能力的方法，按以下步骤进行：

一、优化hNanog基因序列合成：在不改变hNanog基因编码氨基酸序列的前提下，对hNanog基因的密码子进行优化，得到优化的hNanog基因；

二、载体连接：利用EcoRI和NdeI对优化的hNanog基因进行双酶切，获得目的基因片段，再利用EcoRI和NdeI对pET28b质粒进行双酶切，获得载体片段，将目的基因片段和载体片段于16℃连接24h，获得pET28b-nanog重组表达载体；

三、感受态大肠杆菌低温诱导优化的hNanog重组蛋白质表达：将pET28b-nanog重组表达载体转化进入大肠杆菌感受态细胞，经37℃恒温箱培养12小时后，回收全部菌落至含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，再向LB培养基中添加0.4mol/L的IPTG，在25℃、180rpm摇床培养12-18小时，之后于3500rpm离心10min，弃上清，收集菌体；

四、提取与纯化重组蛋白质：加30mL6mol/L盐酸胍至菌体中，200W超声破碎菌体，每次15s，重复6次，然后于12000rpm、4℃条件下离心30mins，取上清液，利用AKTApurify层析系统纯化，获得hNanog重组蛋白；

五、重组蛋白质诱导BMSCs成骨实验：将BMSCs接种到24孔板，每孔中5×10³个细胞，在每孔中添加500μL维持培养基，于37℃，5％CO₂条件下培养至贴壁生长后，去除维持培养基，每孔加入500μL成骨分化培养基和100nmol/L地塞米松，然后在每孔中加入25μLhNanog重组蛋白质，使hNanog重组蛋白质终浓度为50～500nmol/L，培养2～3周；

步骤一所述优化的hNanog基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明具有以下有益效果：

本发明采用重组蛋白质导入法代替载体导入外源基因的方法。重组蛋白质的安全性已经得到广泛认可，作为药物已广泛的应用于肿瘤、感染、造血障碍等疾病临床治疗。重组蛋白质导入法没有载体和转录基因进入细胞内，因此不存在改变细胞基因组的危险，从根本上解决了可能癌变的问题。另外，重组蛋白质导入技术更为简便，容易操作，降低了促进MSCs体外分化的难度。

本发明将hNanog重组蛋白质导入BMSCs，可以显著的提高其分化能力，这为提高患者MSCs的分化能力提供新的安全途径，推动MSCs的临床应用发展。

附图说明

图1为实施例1中hNanog重组蛋白质对BMSCs细胞分化能力的影响的细胞形态图；图2为实施例1中Gomori钙钴法检测BMSCs细胞中碱性磷酸酶活性的结果；图3为实施例1中BMSCs细胞中钙离子相对值的柱形图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。