[发明专利]一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法

权利要求书

1.一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法，其特征在于，该转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法包括：

步骤一，拟南芥AtWUS基因克隆和植物表达载体构建，克隆拟南芥AtWUS基因，构建pCAMBIA2301-35s-AtWUS植物表达载体；

步骤二，根据β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因(uidA)瞬时表达率的多少和细胞存活率的高低，结合影响根癌农杆菌遗传转化的相关因素，相关因素包括预培养时间、菌液浓度、乙酰丁香酮AS浓度、侵染时间、共培养时间和共培养温度，设计实验，确定橡胶树连续继代易碎胚性愈伤组织遗传转化的优化条件；

步骤三，以橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织在含有Kan浓度梯度的继代增殖培养基中的生长速率为指标，测定热研88-13易碎胚性愈伤组织对Kan敏感浓度为100～125mg/L，用于抗性愈伤组织的筛选；

步骤四，抗性愈伤组织、胚状体和再生植株的获得，共培养结束后，将热研88-13易碎胚性愈伤组织转入抑菌培养基中进行抑菌处理，18天后，转移到卡那霉素为100～125mg/L的筛选培养基中，经过4个月的筛选，长出鲜黄色的抗性愈伤组织，把经过GUS染色为阳性的愈伤组织增殖1～2个月后诱导胚状体和植株再生，结果从热研88-13获得了5个抗性易碎胚性愈伤组织系，从抗性愈伤组织共诱导出了843个胚状体，21株拟转化植株；

步骤五，组织化学检测和分子检测，切取14株热研88-13抗性拟转化植株的子叶进行GUS染色，结果有6株呈蓝色阳性，并且阳性植株具有一定表型特征，选取7株热研88-13抗性植株和3株对照一起进行分子检测。

2.如权利要求1所述的转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法，其特征在于，步骤一具体包括：

称取0.5克拟南芥新鲜叶片，提取拟南芥RNA，采用Transtart II First-strandcDNAsynthesissupermix试剂盒合成cDNA，根据NCBI中登录号为NM_127349的AtWUS基因ORF设计一对特异引物，上游引物为WF:5‘CGGGATCCCGATGGAGCCGCCACAGC3’，下游引物为WR：5‘GCGAGCTCGCCTAGTTCAGACGTAGCTCAAGAGAAG3’，在上下游引物5‘端各加一个BamHI和SacI酶切位点；

以合成的AtWUScDNA为模版，WF、WR为特异引物，用聚合酶链式反应扩增AtWUS基因，PCR产物通过琼脂糖凝胶1.0％电泳和凝胶成像系统的观察，切下预期大小的目的片段，称重，然后用Wizard DNAClean-UpKit回收纯化目的片段，用pEASY-T1CloningKit对目的片段进行TA克隆，16℃过夜连接，得到pEASY-T1克隆载体连接反应液；

制备大肠杆菌E.coliJM109感受态细胞，在冰上按照100μL/管分装，取出1管大肠杆菌感受态细胞置于冰上，待溶解后加入5.0μlpEASY-T1克隆载体连接反应液，以转化E.coliJM109感受态细胞；

挑选固体培养基上的几个单菌落分别以WF和WR为引物，挑选的菌体为模板，2×EasyTaqPCRSuperMix进行PCR，对转化重组子进行PCR检测，提取大肠杆菌质粒DNA，用BamHI和SacI双酶切，以鉴定菌落PCR阳性重组子，将PCR阳性克隆的菌液送往深圳华大基因公司进行测序检测；

中间植物表达载体pCAMBIA2301-uidA的构建：分别用HindIII2.0μL和EcoRI2.0μL双酶切pCAMBIA2301-MCS和pBI121-uidA两载体，分别回收pCAMBIA2301-MCS大片段和pBI121-uidA小片段，将回收的两片段用T4-DNAligase1.0μL连接，重组子进行双酶切检测；

植物表达载体pCAMBIA2301-AtWUS的构建：用BamHI和SacI分别双酶切pCAMBIA2301-uidA和pEASY-T1-AtWUS；分别回收pCAMBIA2301-uidA大片段和pEASY-T1-AtWUS小片段；将回收的两片段连接，在PCR管中完成连接反应，16℃水浴，连接过夜；将连接产物转化大肠杆菌JM109；对重组子进行双酶切检测。