[发明专利]一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法。

背景技术

植物体细胞胚发生和器官发生是极其复杂的过程。近年来的研究表明，众多基因参与了植物体细胞胚发生的调控，其中WUS(WUSCHEL)基因是一个典型的干细胞决定基因。1996年Laux等利用EMS诱变技术鉴定了WUS，发现其基因突变体影响着顶端分生组织和花分生组织的发育，由此推断WUS在顶端分生组织和花分生组织中起着关键性的作用，并维持着结构和功能的统一。Mayer等研究发现WUS编码291个氨基酸，是同源域蛋白(homeodomainprotein)中的一个新亚型。在植物胚胎发育过程中，WUS基因在16细胞胚的中央4个细胞中表达，鱼雷胚时期表达区域下移到第3层细胞，而在胚晚期以及胚后茎尖分生组织中，WUS在第3层细胞之下表达。在顶端分生组织中，干细胞组织中心表达的WUS决定其上的细胞成为干细胞，而由干细胞所表达的CLV3蛋白通过细胞间隙移动到干细胞组织中心的周边，通过WUS/CLV3之间的反馈调节环来完成器官的启动和干细胞的维持。Zuo等(2002)用T-DNA标签法筛选出pga6突变体，用一种化学诱导的激活标签系统鉴定了拟南芥PGA6基因的两个等位基因，当它们被诱导过度表达时，在不添加任何外部激素的情况下，所有被检测的组织和器官高频率地形成体细胞胚。当诱导剂取消时，所有这些体细胞胚可以直接萌发成可育的成年植株。经分析PGA6与WUSCHEL(WUS)相同。研究结果表明WUS/PGA6在体细胞胚发生过程中也有关键作用，可能是通过促进营养性向胚性的转变、和/或保持胚性干细胞的性质而起作用的。

Li等(2004)用含有35S-35S-WUS的植物表达载体pBKB转化烟草使WUS基因增强表达，结果转基因烟草地上部分出现许多异常的细胞分裂和异位器官发生，形成许多突起，扫描电子显微镜分析表明突起由许多小而密集的细胞组成，类似分生组织细胞；部分突起能够发育成分生组织或花芽，表明WUS基因与器官发生有关。Arroyo-Herrera等(2008)利用诱导型启动子将WUS基因转入咖啡中诱导WUS基因的超表达，结果体细胞胚的发生提高了4倍。

天然橡胶是国家重要战略资源，天然橡胶的主要来源是橡胶树(Heveabrasiliensis)，橡胶树组织培养体细胞胚发生和植株再生是橡胶树生物技术研究的重要内容。当前，从橡胶树组织培养高频率地得到再生植株仍然存在着困难。植物体细胞胚发生和器官发生重要基因的分子机理研究为橡胶树组织培养植株再生的遗传性状改良提供了一条新的途径。目前生产上橡胶树种植主要是用芽接树，用生产上表现性状良好的母本植株的芽条作为接穗，以实生苗作为砧木进行嫁接。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法，以解决橡胶树组织培养过程中侧芽发生难的问题，所取得的侧芽、侧枝有实际应用于嫁接的潜力。

本发明实施例是这样实现的，一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法，该转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法包括：

步骤一，拟南芥AtWUS基因克隆和植物表达载体构建，克隆拟南芥AtWUS基因，构建pCAMBIA2301-35s-AtWUS植物表达载体；

步骤二，根据uidA基因瞬时表达率的多少和细胞存活率的高低，结合影响根癌农杆菌遗传转化的相关因素，相关因素包括预培养时间、菌液浓度、乙酰丁香酮AS浓度、侵染时间、共培养时间和共培养温度，设计实验，确定橡胶树连续继代易碎胚性愈伤组织遗传转化的优化条件；

步骤三，以橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织在含有一定Kan浓度梯度的继代增殖培养基中的生长速率为指标，测定热研88-13易碎胚性愈伤组织对Kan敏感浓度为100～125mg/L，用于抗性愈伤组织的筛选；

步骤四，抗性愈伤组织、胚状体和再生植株的获得，共培养结束后，将热研88-13易碎胚性愈伤组织转入抑菌培养基中进行抑菌处理，18天后，转移到卡那霉素为100～125mg/L的筛选培养基中，经过4个月的筛选，长出鲜黄色的抗性愈伤组织，把经过GUS染色为阳性的愈伤组织增殖1～2个月后诱导胚状体和植株再生，结果从热研88-13获得了5个抗性易碎胚性愈伤组织系，从抗性愈伤组织共诱导出了843个胚状体，21株拟转化植株；