[发明专利]一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法

权利要求书

1.一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，其特征在于：以红豆杉种子为外植体，经灭菌、接种、二次灭菌、接种，诱导产生红豆杉种子内生菌，再培养红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤如下：

A、外植体的选择和灭菌处理：以‘曼地亚’红豆杉（Taxus media）种子为外植体，以洗洁精浸泡，摇床100-150转摇15-20分钟，再用清水冲洗，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1%的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗，备用；

B、外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体种子，接种在含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8，培养，至在种子周围有菌丝形成；

C、二次灭菌：将步骤B中得到的种子用0.1%氯化汞二次灭菌，无菌水冲洗；

D、内生菌的诱导：将经过步骤C中得到的外植体种子，继续培养于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8，至出现红豆杉种子内生菌；

E、内生菌培养：将步骤D中得到的红豆杉种子内生菌置于PDA固体培养基进行培养，然后再挑取部分菌斑置于PDA 液体培养基中培养，培养3天后检测紫杉醇含量；

F、紫杉醇提取：将步骤E中的发酵物用纱布过滤，将滤液部分用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相，取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取1次，收集有机相，菌丝部分经液氮研碎，超声处理，静置过夜后用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相，重复处理1次，将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35℃下旋蒸至液体全部蒸发，残留物体用溶解于少量甲醇中，滤膜过滤，定容至10mL备用；

G、紫杉醇提取含量检测：经HPLC检测，真菌产生的发酵物中含有紫杉醇，平均含量为0.315mg/L。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的红豆杉为红豆杉科红豆杉属植物‘曼地亚’红豆杉（Taxus media）。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤A、外植体的选择和灭菌处理时：所用洗洁精浓度为2%～3%，浸泡和冲洗时间为15-30分钟，0.1%的氯化汞浸泡灭菌时间为9-14分钟，无菌去离子水冲洗次数为6-8次。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤B、外植体接种时：培养时间为3-5天。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤C、二次灭菌时：二次灭菌时间为8-12min，无菌水冲洗6-8次。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤D、内生菌的诱导时：培养温度为21±2℃，光照强度为1600Lux，光照时间为14小时，培养时间为7-10天。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤E、内生菌培养：液体培养时，每个三角瓶的接种量为 2%，装液量为 200mL / 500mL，摇床培养，培养温度为 27℃，转速为 150r / min。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤F、紫杉醇提取：超声处理时间为25-35min，滤膜过滤时用0.45μm滤膜。

10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤G、紫杉醇提取含量检测：色谱条件为：C18柱 ：250mm×46mm ；流动相，甲醇：水(v/v)=60：40；压力：1506PSI=10.39MPa；保护压力：100LO-Pr；流速O．7mL/ min，检测波长228nm，灵敏度，0.1AUf's，柱温35℃。