[发明专利]一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及紫杉醇的产生，特别是一种通过红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法。 

背景技术   

紫杉醇（Taxol），是从红豆杉属 (Taxus  spp.) 植物中分离得到的一种具有独特抗癌作用的二萜类化合物，具有很高的开发利用价值，是目前世界主流的抗癌药物之一。化学名称: 5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]。化学式为 C₄₇H₅₁NO₁₄，分子量是 853.92，白色结晶体粉末，无臭，无味，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂，熔点 213～216℃。1967年美国北卡罗莱纳州三角研究所的Wall博士和Wani博士发现了紫杉醇。进一步研究发现紫杉醇能与微管紧密地结合，是已知的第一种能和微管蛋白聚合体相互作用从而抑制细胞有丝分裂的药物。美国国家癌症研究所和约翰霍普金斯大学医学院大量临床研究的数据表明，紫杉醇在治疗卵巢癌和乳腺癌方面效果显著。

1992年12月，美国国家食品与药品管理中心正式批准：紫杉醇为晚期卵巢癌的治疗药物。随后又批准用于治疗乳腺癌。目前紫杉醇是最好的治疗卵巢癌和乳腺癌的药物，价格非常昂贵，市场售价为4800美元/克。1994年紫杉醇创世界抗癌药物全球销量冠军。2000年紫杉醇销量创百亿（后受原料供应未有进一步上升），但由于野生红豆杉资源濒危，2002年中央发文严禁砍伐野生红豆杉，鼓励人工种植。今天，紫杉醇已经被成功地用于对多种恶性肿瘤的治疗（包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、卡波氏肉瘤等）。 

但是紫杉醇的自然资源---红豆杉和东非罗汉松（1999年测知含紫杉醇）数量有限且生长地十分缓慢。且其中有效成分的含量非常低（每公斤树皮仅能提取0.1g紫杉醇粗品）。最初，用于治疗的紫杉醇都来源于太平洋红豆杉，治疗一个病人需要6棵百年树龄的红豆杉。尽管现在紫杉醇以及它的抗癌同源衍生物可以通过其前体进行化学半合成制得。但是部分前体还需要从红豆杉中分离得到，产量受到制约。 

目前，生产紫杉醇原料药有以下几种途径：①直接从红豆杉树皮或整株红豆杉植株中提取； ②半合成法，即先从红豆杉中提取10-DAB等中间体，再经合成为紫杉醇成品； ③培养能产生紫杉醇的红豆杉细胞 ；④全合成法，但由于步骤多，成本高尚未投入生产；⑤发酵法：培养寄生在红豆杉树木身上的某些真菌来获取紫杉醇。其中发酵法属于“环境友好型”工艺，利用来源丰富的淀粉类原料，属于绿色农产品原料。而且对环境无污染，科学家普遍认为，真菌发酵法生产紫杉醇代表着紫杉醇生产的未来方向。 

发明内容

针对紫杉醇原料药市场缺口较大的问题，本发明目的是提供一种通过红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法。 

本发明的技术方案是： 

一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，以红豆杉种子为外植体，经灭菌、接种、二次灭菌、接种，诱导红豆杉种子内生菌，再培养红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法。

前面所述的方法，优选的方案在于：步骤如下： 

A、外植体的选择和灭菌处理：以‘曼地亚’红豆杉（Taxus media）种子为外植体，以洗洁精浸泡，摇床100-150转摇15-20分钟，再用清水冲洗，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1%的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗，备用；

B、外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体种子，接种在含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8，培养，至在种子周围有菌丝形成；

C、二次灭菌：将步骤B中得到的种子用0.1%氯化汞二次灭菌，无菌水冲洗7-8次；

D、内生菌的诱导：将经过步骤C中得到的外植体种子，继续培养于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8，至出现红豆杉种子内生菌；

E、内生菌培养：将步骤D中得到的红豆杉种子内生菌置于PDA固体培养基进行培养，培养3天后再挑取部分菌斑置于PDA 液体培养基中培养，培养3天后检测紫杉醇含量；