[发明专利]一种基于荧光定量PCR检测CYP2A6全基因缺失的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测CYP2A6全基因缺失的方法。

背景技术

CYP2A6基因是人细胞色素P450基因超家族的一员，其编码的蛋白为一种重要的代谢酶，参与多种药物及有毒化合物在人体内的代谢。CYP2A6基因在人群中表现出广泛的多态性，其中CYP2A6全基因缺失在中国人群中的发生频率为5％-15％。

替加氟以及以替加氟为主要活性成分的化合物是目前临床上应用最为广泛的抗嘧啶类药物，对消化道肿瘤及等多种实体瘤均有良好治疗效果。

大量研究表明，CYP2A6全基因缺失多态性与S-1和UFT等以替加氟为活性成分的药物的药效密切相关。未携带该多态性的患者相对于发生基因缺失的患者有更高的药物应答率和更长的生存时间。此外，CYP2A6全基因缺失多态性与人对尼古丁的依赖性(烟瘾)及多种癌症的易感性都有紧密的联系。

传统检测CYP2A6全基因缺失多态性的技术主要是PCR-凝胶电泳。这种方法成本低，重复性好，然而需要多次的PCR后处理，既操作复杂，又容易发生污染而产生假性结果。SmartPCR技术很大程度上弥补了PCR-凝胶电泳技术的不足之处，可以在短时间内检测出CYP2A6全基因纯合缺失，然而其无法检测出CYP2A6全基因杂合缺失的样本。

基于实时定量PCR技术对基因拷贝数进行定量的方法已成功应用于基因缺失的检测技术。其基本原理是设计一套引物探针组合来特异性扩增待检测的目的基因(靶基因)，同时设计一套引物探针组合来扩增一个在人基因组中保持拷贝数高度稳定的基因(内参基因)。在一次实时定量PCR反应中，同时对一个样本的靶基因和内参基因进行扩增，并通过二者的扩增指标(Ct值)，计算二者拷贝数的比例。在未发生基因缺失的情况(也未发生异常扩增)，靶基因和内参基因的拷贝数比例应该是1:1，即两种基因在基因组中均以正常二倍体的形式存在；而当靶基因发生杂合缺失的情况下，靶基因与内参基因的拷贝数比例应该是0.5:1，即内参基因以正常二倍体的形式存在，而靶基因则只呈现出单倍体的状态；而当靶基因发生纯合缺失时，扩增靶基因的引物探针组合不能产生扩增信号，而内参基因的扩增则正常。在进行样本检测时，只需将一个未发生基因缺失的样本作为对照(质控品)，则可以很清楚地判断待检测样本是否发生了基因缺失，以及该缺失是杂合状态还是纯合状态。

然而，该技术至今未见应用于CYP2A6全基因缺失的检测；其根本原因是CYP2A6基因与CYP2A7基因及CYP2A13基因具有非常高的序列同源性(90％以上)，因而设计一套适宜于荧光定量PCR反应高特异性扩增CYP2A6基因的引物探针组合十分困难。

发明内容

本发明提供一种基于荧光定量PCR检测CYP2A6全基因缺失的方法，通过分别设计针对于CYP2A6基因和白蛋白基因(ALB)的高特异性引物，利用荧光定量PCR技术来快速准确检测CYP2A6全基因缺失的方法。

为实现以上发明目的，本发明的技术方案如下。

该检测方法包括以下环节：

(1)基因特异性引物的设计

针对CYP2A6基因设计的序列特异性引物探针组合，序列如下:

Fp(上游引物):5’-TCCCACCCTACTCCCTCTCTC-3’

Rp(下游引物):5’-GGAGGTGAACGCGGGA-3’

Probe(探针):5’-FAM-TGGAGACAGGCCAGGGGGCG-BHQ2-3’

针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合，序列如下:

Fp(上游引物):5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’

Rp(下游引物):5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’

Probe(探针):5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’

其中，FAM为6-carboxyfluorescein；HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2

(2)模板的制备:提取待测样本的基因组DNA；

(3)实时定量PCR:针对环节(1)中的两种特异性引物，建立被测样本的检测体系：