[发明专利]一种中链烷烃的生产方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，特别涉及一种中碳链烷烃的生产方法。 

背景技术

烷烃，是化石能源的主要组分，比如石油的分离产物汽油、柴油以及航空燃油等，都是由不同碳链长度的烷烃组成的。而近年来，随着化石能源的日趋枯竭，以及原油消耗量的激增，化石能源供给量不足和怎样实现可持续发展，已经成为人类所必须关注的问题。因此，关于如何利用可再生能源替代化石燃料的研究，逐渐成为新生的热点课题。 

目前应用最为广泛的化石能源替代品，主要包括燃料乙醇、燃料丁醇以及生物柴油等。但是这几种替代物在应用过程中，都存在许多问题，比如醇类汽油极易形成分层并且腐蚀发动机橡胶、生物柴油原料成本及生产工艺能耗均较高等，致使它们不可能完全替代汽油、柴油等烃类物质。所以，为化石能源寻求一种更好的可再生替代物，即一种低成本、高效率的烷烃生产方法，可谓迫在眉睫。 

烷烃主要来源于石油和天然气，也可以通过自然界中一些物种的新陈代谢产生，比如植物的角质层蜡、昆虫的信息素等，但是学术界对于利用微生物这一“细胞工厂”来生产烷烃的研究却少之又少。随着现代分子生物学尤其是合成生物学的飞速发展，利用基因工程的手段，调控烷烃合成过程中相关酶的表达，使微生物细胞只需通过简单的代谢就可以产生烷烃，是生产可再生能源的前沿技术。该方法为传统石化燃料供给不足、新型生物燃料不能完全替代石化燃料等问题提供了一个绝佳的解决方案。与其他菌株相比，大肠杆菌具有遗传 背景清楚、易于改造、生长速度快、适合高密度发酵等优点，是微生物法合成化学品和燃料的理想菌株。利用大肠杆菌生产生物烷烃是一种不争地、不靠天、可持续生产的新途径。 

与公知技术相比，本发明具有以下优点： 

(1)直接利用微生物以可再生生物质为原料代谢得到的烷烃，可大大缓解化石能源供给不足的问题。 

(2)通过本发明得到的烷烃，与石油中的烷烃无异，更接近化石燃料本身的性质，克服了燃料乙醇、燃料丁醇、生物柴油等存在的一系列问题，利用率极高。 

(3)微生物只需通过简单的代谢便可产生烷烃，生产周期短，不受场地、季节等因素影响，不占用耕地资源，容易实现工业化生产。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种在重组大肠杆菌(Escherichia coli),以自然界中大量存在并可再生的脂肪酸为原料，合成烷烃的可再生能源工艺路线，使微生物可以作为细胞工厂，发酵生产烷烃。 

本发明首先对来自大肠杆菌K12菌株中的酰基辅酶A合成酶基因进行过表达，构建基因工程菌，即将基因fadD克隆至原核表达载体pACYCDuet-1中，得到重组质粒pACYCDuet-fadD，质粒1。表达的酰基辅酶A合成酶可以通过外源性流加C14:0/C16:0等中链脂肪酸的方式，催化脂肪酸生成代谢产物酯酰辅酶A，并使这一前体物质在宿主细胞中得到积累。 

再异源表达来自不动杆菌ADP1(Acinetobacter baylyi)中的酰基辅酶A还原酶。具体为将不动杆菌中酰基辅酶A还原酶基因acr克隆至原核表达载体 pETDuet-1中，得到重组质粒pETDuet-acr，质粒2。表达的酰基辅酶A还原酶可以催化细胞中积累的酯酰辅酶A还原为C14/C16的脂肪醛。 

最后，异源表达来自念珠藻(Nostoc punctiforme)中的醛脱羰基酶。即将醛脱羰基酶基因dc克隆至原核表达载体质粒2中，得到重组质粒pETDuet-acr-dc，质粒3。表达的醛脱羰基酶可以催化脂肪醛脱去羰基，生成烷烃。 

将重组质粒1/质粒3共同转入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导重组质粒进行共表达，即可通过外源性流加C14:0/C16:0脂肪酸的方式，使脂肪酸逐步代谢生成C13/C15等碳链长度不等的烷烃，其中外源性流加C14:0脂肪酸得到的烷烃产量为2.17mg/L，外源性流加C16:0脂肪酸得到的烷烃产量为1.81mg/L，从而得到利用重组大肠杆菌直接合成烷烃的可再生资源工艺路线。 

本发明提供的方法，在大肠杆菌中表达特异性调控酰基辅酶A合成、酰基辅酶A还原以及醛脱羰基反应的关键酶基因，可以利用微生物代谢天然脂肪酸得到的烷烃，并进行高密度发酵，为可再生烷烃的合成开辟一条新的途径。 

附图说明

图1：DNA琼脂糖凝胶电泳。右侧为纯化后的大肠杆菌中酰基辅酶A合成酶基因PCR产物，1686bp。左侧为DNA大小标准品。